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猪高致病性蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome,PRRS)病毒的变异株引起的一种急性高致死性传染病,又称猪“高热病”。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)持续性感染会引起免疫抑制,引发细菌或病毒的继发性感染,从而增加治疗难度。因此若能从遗传水平提高猪对PRRSV的抵抗力,进而实施抗病育种是解决PRRS危害的可行措施。补体系统是先天性免疫的重要组成部分,是机体抵抗病原体的第一道防线,在抗病毒中具有重要作用。然而研究猪感染PRRSV后补体系统的应答反应及与机体互作鲜有报道,仅见肖书奇(Xiao et al.,2010)和周平(Zhou et al.,2011)分别发表的两篇文章涉及到转录水平上部分补体基因的表达信息。前者芯片结果显示约克夏与长白杂交猪感染经典北美PRRSV后4天和7天采肺组织样,补体激活因子是表达上调的,补体抑制因子是表达下调的,补体系统处于持续激活状态;而后者结果表明通城猪HP-PRRSV感染后5天,肺泡巨噬细胞中补体抑制因子CLU显著上调,补体激活的关键因子CFP与C3的表达被下调,补体系统受到抑制。因此,为更深入研究感染PRRSV后猪补体系统的应答反应与功能,本研究以课题组前期已开展的通城猪与大白猪人工感染试验材料和感染前后转录组分析数据为基础,筛选到了高致病性猪蓝耳病毒(Highly Pathogenic PRRS,HP-PRRSV)感染机体后补体系统差异表达基因,并对补体系统开展以下研究:(1)补体通路中的基因分析:以通城猪与大白猪HP-PRRSV感染组各3头及对照组各3头的肺泡巨噬细胞RNA为材料,利用Illumina Hi Seq TM2000进行深度测序,并用转录组测序(RNA Sequencing,RNA-Seq)数据分析通用软件Tophat 2.0对测序产出reads进行定位。然后统计转录本和基因的差异表达情况,用阈值Fold Change大于等于2或小于等于2,同时P值小于等于0.01,筛选HP-PRRSV感染前后补体系统差异表达基因。测序结果显示:通城猪中补体基因C3AR、C4A、C5与丝氨酸相关蛋白酶1(MBL-associated serine protease,MASP-1)基因被上调,会有利于补体凝集素途径的激活;而补体CFP基因的下调与CFH的上调,会对补体旁路途径产生抑制;补体抑制因子CD55、CD59、CLU与C4BPB的上调,会抑制补体转化酶和攻膜复合物的形成,从而对整个补体系统产生抑制作用。大白猪中,补体凝集素途径MASP-1基因的上调、经典途径C1R上调以及C4A与C3AR的上调,有利于补体系统经典途径和凝集素途径的激活;补体旁路途径抑制子CFH的上调及稳定转化酶的CFP的下调,会对补体旁路途径激活产生抑制作用;补体抑制因子C1R、CD55、CD59、CLU、C4BPB被上调,会抑制转化酶及攻膜复合物的形成,对整个补体系统产生抑制。综上所述,从转录组数据看出,通城猪与大白猪的补体系统都激活同时又受到抑制,但是由于通城猪中检测到补体系统三条途径交汇点C5基因的上调,而大白猪中没有检测到,因此推断通城猪补体系统激活程度比大白猪高一些。(2)补体系统差异表达基因的定量检测分析:以通城猪与大白猪HP-PRRSV感染组各3头及对照组各3头的肺泡巨噬细胞编码脱氧核糖核酸(Coding deoxyribonucleic acid,c DNA)为模板,通过荧光实时定量验证了通城猪与大白猪中补体差异表达基因关键因子在感染HP-PRRSV后的表达情况,定量结果显示:在通城猪与大白猪中补体基因C3AR、C4A、CFH、CD55、CD59与CLU呈上调表达,而补体基因CFP下调表达,与转录组数据基本一致即补体系统激活同时又受到抑制。(3)HP-PRRSV感染通城猪与大白猪7天后免疫组化检测补体C3d在肺组织中的分布:结果显示HP-PRRSV感染的通城猪与大白猪中都检测到了补体C3d的大量沉积,而阴性对照组未检测到阳性信号,并根据有关文献报道补体C3d是补体系统激活标志,得出结论通城猪与大白猪补体系统被激活。(4)补体系统中心因子C3在HP-PRRSV感染后血清中的变化:以HP-PRRSV感染的通城猪与大白猪各3头为材料,以HP-PRRSV感染0天的血清为对照,用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中补体C3的水平变化,结果显示:通城猪中感染后5天与7天的C3水平显著高于感染前;在大白猪中补体C3水平一直处于稳定,且感染HP-PRRSV后的C3水平与感染前差异不显著。通城猪与大白猪相比,通城猪在感染后第5天补体C3水平显著高于大白猪第5天血清中补体C3水平,感染后第7天补体C3水平极显著高于大白猪第7天水平,这说明HP-PRRSV感染后通城猪补体系统激活程度比大白猪高,同时相关文献报道血清中补体C3水平升高利于机体清除病毒,因此也推断出通城猪与大白猪相比可能更有效的清除蓝耳病毒。本研究从转录水平与蛋白水平初步探索了对HP-PRRSV感染通城猪与大白猪后补体系统的应答反应:从转录数据来看HP-PRRSV感染通城猪与大白猪后,补体系统激活的同时又受到补体抑制因子的抑制。蛋白水平上免疫组化检测到补体系统激活标志蛋白C3d在通城猪与大白猪肺组织中大量沉积,表明补体系统都被激活;而ELISA测定血清中补体C3水平在品种间存在差异:感染高致病性蓝耳病毒后通城猪第5天与第7天血清中补体C3水平都显著高于大白猪第5天和第7天水平。蛋白水平上结合免疫组化结果表明HP-PRRSV感染后,通城猪与大白猪补体系统都被激活,但通城猪补体系统激活程度比大白猪高,且可能更有效的清除蓝耳病毒,希望这些结果为今后研究蓝耳病毒与补体互作以及PRRSV抗病育种提供一定的参考。