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家兔的毛色不仅是品种标志,更具有重要的经济价值。家兔毛色种类繁多,其中麻色家兔因经典美观、不需要染色易于加工为毛皮制品而广受人们喜爱。经前人研究发现agouti信号蛋白基因(ASIP)、酪氨酸酶受体蛋白1(TYRP1)、酪氨酸酶基因(TYR)、黑素皮质激素基因(MLPH)、黑素皮质激素受体1基因(MC1R)这5个基因对家兔的毛色有影响,但是上述基因对麻色家兔影响的机制尚不明确。因此,本实验用以下方法试图阐述这5个基因影响麻色家兔的机制。 本实验选择三个经专门化培养的彩色系肉兔群作为研究对象,共计820只家兔,研究这5个基因对麻色家兔的影响。首先,我们用桑格测序对这5个基因的每个外显子和部分内含子的基因序列进行SNPs的寻找,用DNAMAN、Chromas等软件对SNPs进行基因分型,利用建立家系的方法对得到的基因型进行验证。然后,用相对定量方法对这5个基因的表达情况进行分析。随后,用双荧光素酶报告系统对ASIP基因启动子的活性区域进行分析,并利用在线软件对ASIP基因启动子区域甲基化情况进行分析。最后,用绝对定量方法分析ASIP基因的基因拷贝数变异情况。 主要研究结果如下: (1)这5个基因中共发现了18个SNPs位点,其中6个SNPs位点与前人研究结果一致。而用系谱对这18个SNPs位点进行验证,发现只有4个SNPs位点与毛色性状相关,分别是ASIP基因第二外显子c.5_6insA、TYR基因第四外显子c.1118C>A、MC1R基因c.280_285del6和c.304_333ins30。 (2)当ASIP基因第二外显子c.5_6insA发生纯合突变时,家兔不表现为麻色性状,而且经系谱验证此突变为隐性;当MC1R基因c.280_285del6和c.304_333ins30发生纯合突变时家兔表现为黑色毛色性状,而且经系谱验证此突变为隐性;当TYR基因第四外显子c.1118C>A纯合突变时,家兔表现为白色,而且经系谱验证此突变为隐性。 (3)确定了纯合的麻色家兔的基因型为AACCEE。然后用这种基因型的家兔作为父母代建立家系验证此结论的正确性,得到了子代均为麻色性状的家兔。通过基因型和性状关联发现,TYR基因是ASIP基因和MC1R基因的上位基因,而MC1R基因是ASIP基因的上位基因。但是在麻色家兔中,我们发现这些家兔毛色有深有浅。根据对毛发不同色彩区域的测量结果发现,兔毛棕色区域越大,则麻色家兔毛色越浅,棕色区域越小,麻色家兔毛色越深。 (4)相对定量结果表明ASIP基因的表达量是影响家兔麻色深浅的原因,而且ASIP基因的表达越高,家兔棕色区域越大。ASIP基因启动子活性区域在-1001~-912之间,并且ASIP基因启动子区域CpG岛含量较少,因此ASIP基因CpG岛的甲基化可能对ASIP的表达没有影响。绝对定量的数据表明ASIP基因的拷贝数变异能够影响ASIP基因的表达,所以ASIP的基因拷贝数变异可能是影响麻色深浅的原因之一。 总的来说,基因型决定了家兔麻色的性状,ASIP基因的表达和基因的拷贝数变异可以影响麻色家兔毛色的深浅。