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第一部分miR-34a对食管鳞癌细胞系TE-1生物学功能的影响目的:研究人miRNA-34a对食管鳞癌细胞系TE-1生物学功能的影响。方法:通过化学合成的成熟型人miR-34a模拟体及抑制剂,瞬时转染至TE-1细胞中,实时荧光定量PCR检测进行鉴定,检测miR-34a的表达量。采用MTT法和克隆形成实验检测miR-34a对TE-1细胞增殖的影响;流式细胞仪检测对TE-1细胞凋亡的影响;Transwell小室检测对TE-1细胞侵袭功能的影响;细胞划痕实验检测对TE-1细胞迁移功能的影响;Western blot检测凋亡及侵袭相关蛋白的表达。结果:实时荧光定量PCR显示miR-34a在TE-1细胞中的表达量明显上调或下调;通过MTT法和癌灶形成实验,发现miR-34a mimic抑制TE-1细胞的生长和克隆团的形成;流式细胞术检测发现miR-34a mimic促进TE-1细胞的凋亡;Western blot结果显示,miR-34a抑制Bcl-2、PARP-1的表达,增加Bax蛋白表达水平。通过划痕和Transwell侵袭实验,我们观察到转染人源miR-34a mimic的细胞组侵袭迁移能力下降。相反,转染miR-34a inhibitor后,则促进细胞的生长和克隆团的形成,抑制细胞的凋亡,并且可以增加细胞的侵袭迁移能力。Western blot结果显示,miR-34a负性调控迁移相关基因MMP-2和MMP-9的蛋白表达。结论:化学合成的成熟型miR-34a可以转染入TE-1细胞,能显著提高转染细胞中miR-34a的表达量。转染miR-34a后抑制TE-1细胞的生长,促进其凋亡,并且抑制TE-1细胞的侵袭迁移能力。第二部分miR-34a通过下调转录因子YY1的表达影响TE-1细胞的侵袭迁移能力目的:研究转录因子YY1对TE-1细胞侵袭、迁移作用的影响。方法:建立双荧光素酶报告基因,验证YY1是miR-34a的靶基因之一,Westernblot进一步验证二者的相关性;Transwell小室检测对TE-1细胞侵袭功能的影响;细胞划痕实验检测对TE-1细胞迁移功能的影响;Western blot检测侵袭相关蛋白的表达。结果:通过荧光素酶报告基因结果显示miR-34a可明显抑制包含YY13’UTR片段载体的荧光素酶表达,确定了miR-34a与YY1二者之间的关系。 Western blot进一步验证miR-34a抑制YY1的表达。这些结果表明,YY1可能是miR-34a的靶基因之一。转染YY1过表达载体的细胞组侵袭能力高于对照组细胞,沉默YY1的表达则抑制细胞侵袭;细胞共转染miR-34a mimic和shRNA-YY1,Western blot和Transwell实验发现shRNA-YY1能逆转miR-34a对TE-1细胞的侵袭迁移抑制作用。结论:YY1是miR-34a的靶基因,miR-34a在食管鳞癌中具有侵袭迁移抑制作用,可能与其靶基因YY1有关,表达下调的YY1能逆转miR-34a对TE-1细胞的侵袭迁移作用。第三部分X射线对miR-34a和转录因子YY1表达的影响目的:研究电离辐射后TE-1细胞中miR-34a及转录因子YY1的表达方法:实时荧光定量PCR检测miR-34a的表达变化;Western blot检测转录因子YY1的蛋白表达水平。结果:在0、2、4、6、8Gy X射线照射,24、48和72小时后miR-34a的表达量逐渐下降;随着时间和剂量的增加,YY1的蛋白表达量也逐渐增加。结论:YY1是miR-34a的靶基因,X射线照射后,随着时间和照射剂量的增加,YY1表达量逐渐增加,而miR-34a表达量逐渐减少。