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熊蜂是蜜蜂科的一种具有巨大潜力的农业授粉昆虫,在饲养过程中受到许多病原和寄生物的侵袭,如熊蜂微孢子虫、熊蜂孢子虫、熊蜂短膜虫、布赫纳蝗螨和蜂巢小甲虫等。随着现代生态农业的兴起,我国对国外授粉用熊蜂的引进日益增多,由此带来的病虫害入侵风险受到各方关注。国内对熊蜂病原寄生物的研究较少,缺乏针对进境熊蜂相应的检疫措施,为防止由此带来的疫病传入风险,有必要根据进境熊蜂的检疫要求建立相应的检疫方法。本实验以从国内获取的熊蜂和全基因合成的蜂巢小甲虫线粒体细胞色素C氧化酶I基因作为实验材料,通过特异性引物的设计对进境熊蜂的检疫技术进行研究。主要研究成果如下:1.建立并优化了熊蜂短膜虫、熊蜂微孢子虫和蜂巢小甲虫的PCR快速检测体系,所设计的特异性引物分别扩增出了 447 bp、213 bp和205 bp的目的条带。经过优化的熊蜂短膜虫PCR检测体系最佳退火温度为59℃,引物终浓度为0.5μmol/L,循环参数为35个循环;熊蜂微孢子虫的最佳退火温度为57.2℃,引物终浓度为0.5μmol/L,循环参数为45个循环;蜂巢小甲虫的最佳退火温度为52℃,引物终浓度为0.5 μmol/L,循环参数为40个循环。2.所设计的特异性引物Cri-F/R、Nos-F/R和Aet-F/R仅可扩增出熊蜂短膜虫、熊蜂微孢子虫和蜂巢小甲虫的目的条带,对其他熊蜂可感染的病原菌与寄生物无扩增。PCR扩增产物测序结果经同源比对与预期片段序列一致。经验证熊蜂短膜虫Cri-F/R的灵敏度达到1.32x10-6 ng/μL,熊蜂微孢子虫Nos-F/R的灵敏度为2.86x1O4ng/μL,蜂巢小甲虫Aet-F/R的灵敏度为0.77x10-9ng/μL,三种引物对样品的最低检测浓度的重复性均十分良好,说明所建立的这三种PCR检测方法稳定可靠,可以用于进境熊蜂的检疫。3.以所获取的熊蜂样品随机抽取340份作为样本,用建立的PCR快速检测方法进行检测,所获得的熊蜂微孢子虫和熊蜂短膜虫的阳性数量分别为136和137,阳性检测率分别为40.0%和40.3%。