柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CVB5)是造成无菌性脑膜炎和手足口病的重要病原体,其流行呈现周期性,每隔3-6年,即会出现激增趋势,并持续1年左右。但是,对于该种病毒的发病机制目前还不明确。在治疗方面,还未研制出特异性地检测手段及高效治疗药物,对CVB5病毒的研究仍然局限在流行病学调查、基因分析、临床分析等方面。由泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasomepathway,UUP)所介导的蛋白质的降解,是保证细胞正常的生理功能的重要途径。它在细胞分化、细胞周期、凋亡、DNA修复和抗原呈递等各个细胞生命过程中发挥着重要的调节作用。有研究者称,许多病毒已经进化出不同的策略来利用泛素化蛋白酶体途径方便其自身的复制与存活,其中的蛋白酶体亚基α-2型蛋白(PSMA2)可能参与到病毒的复制等生命周期。但是,目前关于CVB5对PSMA2蛋白的影响研究较少,PSMA2蛋白是否参与病毒的复制也不是很清楚。因此,我们欲采用分子生物学和细胞生物学的方法研究CVB5病毒在感染和致病过程中与宿主蛋白PSMA2之间的相互作用,为CVB5病毒的发病机制提供理论基础。本研究工作主要包括三个部分:1.采用RT-PCR、测序进一步鉴定实验室保存的毒株是CVB5,随后采用微载体培养Vero细胞并大量制备CVB5病毒,收毒,测感染滴度,冻存备用。2.研究CVB5感染后宿主PSMA2蛋白表达的应答性变化。利用Real time PCR的方法检测CVB5感染293T和HCT-116细胞后PSMA2在mRNA水平的变化。结果显示293T细胞和HCT-116的mRNA水平整体趋势均是先升高后降低,并在8h显著升高,随后降低的幅度不是很大,与对照组相比,仍是升高的趋势。表明,PSMA2基因是一个病毒可诱导基因,参与CVB5病毒侵染宿主过程。同时,我们还监控了同为蛋白酶体亚基的PSMC2基因的变化,结果表明该基因在293T细胞中其mRNA水平是升高趋势,并在20h显著升高;但在HCT-116细胞中,在8h显著升高,随后缓慢降低,但与对照组相比,仍是升高的趋势。说明了病毒同样对PSMC2基因产生影响,该基因也是一个病毒可诱导基因。采用WB的方法在蛋白水平检测CVB5感染293T细胞和HCT-116后PSMA2蛋白含量的变化。结果显示,在病毒正常增殖的前提下,293T细胞感染CVB5病毒后,蛋白水平呈下降趋势,但HCT-116细胞感染病毒后其蛋白水平呈上升趋势,表明不同种类的细胞对于CVB5病毒的感染有不同的应答。3.成功构建出pcDNA3.1-PSMA2-2×Flag真核表达载体,并采用WB手段检测该载体在293T细胞中稳定表达。向293T细胞中转染该载体,检测过表达PSMA2蛋白后对CVB5病毒滴度的影响,结果表明与对照组相比,过表达PSMA2蛋白后,CVB5的感染滴度上调。综上:PSMA2参与CVB5病毒的增殖过程,为进一步研究病毒感染过程中的作用机制奠定理论基础。