目的:探讨肼致心肌成纤维细胞凋亡的作用及机制;观察外源性NADH的抗肼毒作用。 方法:体外培养S-D大鼠乳鼠(1-3天)心肌成纤维细胞,细胞分四组:正常组(对照组)、肼损伤组、正常+NADH组(NADH组)和肼损伤+NADH组。肼损伤分别采用1、2、4、8、16mM(mmol/l)等5个不同浓度,外源性NADH治疗采用400umol/L浓度。各组细胞分别处理培养72h后,通过用MTT法检测肼的细胞毒作用、光学倒置相差显微镜和Hochest33258染色后荧光显微镜观察细胞处理前后的形态学变化、Annexin V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率和坏死率确定肼诱导心肌成纤维细胞凋亡的浓度;选用凋亡率最高的肼损伤组,通过Rodamine 123荧光染色流式细胞仪检测细胞内线粒体膜电位的变化;Western-blot检测蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的变化探讨肼致心肌成纤维细胞凋亡的机制和NADH的抗肼毒作用。 结果:(一)肼对心肌成纤维细胞的作用: 1.MTT检测显示,肼可以抑制细胞增殖,其作用随肼浓度增高而增强,与正常组比较差异具有显著性(p<0.01)。 2.荧光染色和流式细胞仪检测显示,肼能导致心肌成纤维细胞凋亡,当肼浓度为2mM时凋亡细胞最多,随浓度增大凋亡细胞逐渐减少,坏死细胞逐渐增多。 (二)肼致心肌成纤维细胞凋亡的作用机制和NADH的防治作用: 1.MTT检测显示,肼可以抑制细胞增殖,其作用随肼浓度增高而增强,与正常组比较差异具有显著性(p<0.01);用400umol/L浓度NADH治疗后细胞抑制减弱,与肼损伤组比较差异具有显著性(p<0.01)。 2.光学倒置相差显微镜和Hochest33258荧光染色观察显示,肼损伤组与正常组相比,细胞生长、增殖受到抑制,细胞数明显少于正常组,细胞出现凋亡核浓缩、核边集形态;肼+NADH组细胞生长、增殖较肼损伤组有明显改善,细胞凋亡的核浓缩、核边集减少。 3.流式细胞仪检测显示,肼损伤组细胞凋亡率和坏死率均高于正常组,差异均有显著性(P<0.05),肼+NADH组凋亡率和坏死率均低于肼损伤组(P<0.05)。