【摘 要】
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研究背景和目的前列腺癌（PCa）是全球男性中常见的一种肿瘤,PCa转移是导致死亡的主要原因。环状RNA（CircRNA）是一种环形闭合的RNA分子,由mRNA的前体反向剪接形成。CircRNA通过吸附miRNA、结合RBP分子、调节转录或翻译成多肽的方式参与肿瘤的多种生物学过程。然而CircRNA在PCa中的作用尚未完全阐明。因此,探讨CircRNA在转移性PCa中的生物学功能及发挥的分子机制迫在
【基金项目】
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国家自然科学基金项目《CircSMARCC1经外泌体靶向作用肿瘤相关巨噬细胞调控HMGB1分泌促进前列腺癌骨转移的机制研究》（项目批准号:81972394）； 广东省自然科学基金项目《CircSMARCCl经外泌体靶向作用肿瘤相关巨噬细胞调控HMGB1分泌促进前列腺癌骨转移的机制研究》（项目批准号:2020A1515010066）；
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研究背景和目的前列腺癌（PCa）是全球男性中常见的一种肿瘤,PCa转移是导致死亡的主要原因。环状RNA（CircRNA）是一种环形闭合的RNA分子,由mRNA的前体反向剪接形成。CircRNA通过吸附miRNA、结合RBP分子、调节转录或翻译成多肽的方式参与肿瘤的多种生物学过程。然而CircRNA在PCa中的作用尚未完全阐明。因此,探讨CircRNA在转移性PCa中的生物学功能及发挥的分子机制迫在眉睫。研究方法对PCa患者及匹配的前列腺增生患者血浆行CircRNA测序,筛选出差异表达的分子hsa＿circ＿0003258;qRT-PCR、FISH实验验证其在PCa患者血浆及组织中的表达;Sanger测序、核浆分离、放线菌素等实验验证hsa＿circ＿0003258环状特性及在细胞中的定位;构建敲低和过表达hsa＿circ＿0003258的PCa细胞株后,应用Transwell迁移和划痕愈合实验检测PCa细胞在体外的迁移能力;使用裸鼠尾静脉注射成瘤实验检测PCa细胞在体内的转移能力;进一步在敲低hsa＿circ＿0003258的PCa细胞系中行转录组测序并分析KEGG及GO通路富集情况;利用Western blot验证相关蛋白的表达;随后利用生信预测、RNA-pull down、双荧光素酶实验得到并验证与hsa＿circ＿0003258结合的miR-653-5p;结合RT-qPCR、Western blot及转录组测序结果筛选出miR-653-5p下游分子ARHGAP5并利用回复实验验证信号通路;运用生信预测出与hsa＿circ＿0003258结合的蛋白IGF2BP3,通过RNA pull-down、RIP、荧光共定位实验证实两者的结合;利用生信及转录组测序结果筛选出hsa＿circ＿0003258及IGF2BP3共作用的下游分子HDAC4;通过放线菌素实验验证hsa＿circ＿0003258/IGF2BP3复合物对HDAC4的mRNA稳定性的影响。研究结果Hsa＿circ＿000325在前列腺癌患者的血浆中较前列腺增生患者血浆中低,但在前列腺癌细胞系和前列腺癌患者组织中高表达且其高表达与病人Grade分级、病理T、N分期呈正相关。敲低hsa＿circ＿0003258的PCa细胞株迁移能力显著降低,过表达hsa＿circ＿0003258则出现相反结果。裸鼠肺定植实验显示敲低hsa＿circ＿0003258后,裸鼠肺转移灶数目显著减少。对转录组测序结果行GO/KEGG富集,结果显示敲低hsa＿circ＿0003258影响了 PCa细胞的细胞黏附及MAPK信号通路。敲低hsa＿circ＿0003258后PCa细胞EMT的发生受到抑制,并且p-ERK表达明显降低,而过表达hsa＿circ＿0003258后结果相反。数据库预测hsa＿circ＿0003258可与miR-653-5p结合,双荧光素酶报告实验显示hsa＿circ＿0003258可与miR-653-5p结合并且突变结合位点会使两者的结合减少。回复实验证实hsa＿circ＿0003258通过miR-653-5p激活ARHGAP5的表达。数据库及实验证实 hsa＿circ＿0003258 可与蛋白 IGF2BP3 结合,并且hsa＿circ＿0003258/IGF2BP3 复合物可稳定 HDAC4 的 mRNA 进而促进 HDAC4 蛋白的表达。最后敲低HDAC4的PCa细胞株迁移能力显著降低,并且p-ERK的表达明显降低。研究结论Hsa＿circ＿0003258促进PCa细胞的迁移能力。机制上,hsa＿circ＿0003258竞争性吸附miR-653-5p从而激活ARHGAP5的表达。此外hsa＿circ＿0003258与IGF2BP3蛋白相结合后,稳定HDAC4的mRNA,激活ERK信号通路进而促进PCa的EMT进程,最终导致肿瘤转移。总之,本研究揭示了 hsa＿circ＿0003258/miR-653-5p/ARHGAP5 轴及 hsa＿circ＿0003258/IGF2BP3/HDAC4 轴可作为潜在的调控PCa转移的靶点。
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