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甘蓝(B. oleracea var. capitata)和青花菜(B. oleracea var. italica)有着悠久的栽培历史,种植面积较广,深受人们的喜爱。杂交育种是其主要的育种方式。但甘蓝和青花菜为异花授粉作物,在杂交种亲本系的常规选育过程中,一般至少需要7~8代的连续蕾期自交,才能育成一个稳定的自交系。而通过游离小孢子培养技术,即可在2年内获得纯合的育种材料,这样加快了选择进程,缩短了育种年限,因此,甘蓝类蔬菜游离小孢子培养技术,在优良自交系的创制和提高新品种选育效率等方面具有重要作用。但目前甘蓝和青花菜游离小孢子出胚率较低,甚至在一些基因型中很难获得胚状体,且小孢子胚再生植株频率也较低,这严重妨碍了游离小孢子培养技术的有效应用;此外,在甘蓝和青花菜小孢子后代群体进行倍性鉴定时,缺乏一种简便、经济、实用而又可靠的倍性鉴定方法;甘蓝和青花菜小孢子再生植株的加倍率也需要进一步探讨和提高;甘蓝和青花菜小孢子胚胎发生机理还不清楚。因此研究和明确影响甘蓝和青花菜小孢子胚胎形成和植株再生频率的因素、经济快捷的染色体倍性鉴定方法、染色体加倍效率、胚胎发生的机理,对加快游离小孢子培养技术在甘蓝类蔬菜育种中得到实际应用,具有重要的理论意义和实际价值。本研究以甘蓝和青花菜不同基因型为试材,对影响游离小孢子出胚率和小孢子胚植株再生频率的因素、小孢子再生植株染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数目的相关性、小孢子再生植株群体的自然加倍率和单倍体植株的人工加倍方法、小孢子早期胚胎形成过程中相关基因的差异表达等方面进行了研究,获得主要研究结果如下:1.明确了影响甘蓝和青花菜游离小孢子出胚率的主要因素,研究结果表明:(1)基因型是影响小孢子出胚率的关键因素之一;(2)32.5℃热激1d最适合于供试的绝大多数甘蓝基因型和所有青花菜基因型;(3)单独的低温预处理对3个甘蓝供试基因型的小孢子胚胎发生的诱导作用不大,但是能诱导3个青花菜供试基因型的小孢子胚胎发生;首次明确了低温对甘蓝和青花菜出胚率的影响;(4)低温与热激组合的预处理方式对3个甘蓝供试基因型小孢子出胚率的影响因基因型而异;4℃预处理1~2d并结合32.5℃热激1d均能显著地提高供试的所有青花菜基因型的出胚率,尤其是4℃预处理1~3d并结合32.5℃热激1d这种组合预处理,使在32.5℃热激1d下表现低出胚率的基因型‘TI-111’的出胚率提高63~72倍;首次在青花菜上报道低温预处理与热激相组合的预处理显著地提高了小孢子的出胚率;(5)NLN-13和1/2NLN-13培养基的pH值为6.2或6.4时最适合于所供试的甘蓝基因型和青花菜基因型的游离小孢子培养,比目前在甘蓝类蔬菜中常用的培养基(pH值为5.8)上培养的小孢子出胚率提高2倍。2.明确了影响游离小孢子胚再生成植株的因素,建立了胚培养技术体系。以‘中甘11’和‘TI-111’等基因型为试材,研究结果表明:1%~1.25%琼脂浓度的B5固体培养基最适于小孢子胚的萌发和植株再生;子叶胚再生植株的频率极显著高于非子叶胚,其中以游离小孢子培养约25d的子叶胚再生成植株的频率最高,可达80%以上。通过甘蓝类蔬菜8个不同基因型对上述植株再生体系进行了验证,结果显示其再生频率在77.8%~97.2%之间,且基因型间差异不大。这一胚培养体系基本上解决了甘蓝和青花菜小孢子子叶胚再生成植株频率低的问题。3.通过对甘蓝类蔬菜游离小孢子再生植株的染色体倍性与气孔保卫细胞叶绿体数之间的相关性进行研究,获得了一种快速、实用、可靠且甘蓝、青花菜、芥蓝三者通用的倍性鉴定方法─叶绿体数倍性分界法,即气孔保卫细胞叶绿体数少于或等于10个的为单倍体,大于10而少于或等于15个的为二倍体,大于15个的为多倍体,用此叶绿体数倍性分界法对1153株甘蓝类蔬菜游离小孢子再生植株的倍性水平进行鉴定,其结果与形态学观察法和根尖染色体计数法的吻合率为93.93%,且此倍性鉴定方法不受环境等外界因素的影响。该倍性鉴定方法为甘蓝类蔬菜的早期染色体倍性鉴定提供了一种快速、简单、经济、实用而又可靠的方法。4.对4个甘蓝基因型和5个青花菜基因型的小孢子再生植株群体的自然加倍率进行了研究,结果显示:小孢子再生植株群体的自然加倍率因基因型而异;在小孢子再生植株群体中,除了单倍体和二倍体外,还存在较低频率的多倍体和嵌合体;甘蓝小孢子再生植株群体的自然加倍率(包括二倍体、多倍体和嵌合体)为46.19%~84.62%;青花菜小孢子再生植株群体的自然加倍率(包括二倍体、多倍体和嵌合体)为52.17%~100%。以青花菜‘TI-111’为试材,针对不同预处理方式对小孢子自然加倍率的影响进行研究,结果表明:在4℃预处理1d并结合32.5℃热激1d条件下获得的小孢子再生植株群体的二倍体频率和总加倍率均高于单独32.5℃热激1d。5.分别以甘蓝‘中甘11’和青花菜‘TI-111’单倍体基因型植株为试材,对利用秋水仙素蘸根处理的人工染色体加倍方法的效率进行了研究,结果表明:0.2%秋水仙素浓度处理9~12h或0.4%浓度处理3~9h,‘中甘11’的单倍体植株的加倍效果最好,二倍体频率为23.08%~50%,总加倍率为58.33%~86.42%,成活率为73.33%~93.33%;0.05%秋水仙素浓度处理6~12h时,‘TI-111’单倍体植株的加倍效果最好,二倍体频率为16.67%~37.50%,总加倍率为54.55%~75.00%,成活率57.14%~80.00%。6.利用cDNA-AFLP技术对甘蓝和青花菜小孢子早期胚胎发生相关基因的差异表达首次进行了研究和分析,从256对引物中筛选出了74对有差异的引物对,共获得了164个TDF;其中45个TDF共存在于甘蓝和青花菜中,2个在低温诱导的青花菜小孢子中特异表达,这47个TDF可能与小孢子胚胎形成基因相关。7.通过对差异条带进行回收、克隆和测序,成功获得了26个与小孢子胚胎形成相关的TDF。这26个TDF已经提交到dbEST,GenBank登录号为:GR301387~GR301412(青花菜)、GR301413~ GR301436(甘蓝)。通过序列相似性比对分析,只有TDF7在数据库中没有找到任何相似性序列,其余25个TDF在数据库中均能找到具有相似性的核酸或蛋白序列;根据blastx比对结果将21个已找到相似性蛋白序列的TDF按其推测的生物信息学功能划分为7类,其中1类为未知功能蛋白类,含有2个TDF,其余19个TDF分别6个与信号转导、6个与防御反应、3个与转录翻译调控、2个与水解蛋白基因、1个与裂合酶基因、1个与激素调控有关;且这21个TDF均来自于甘蓝和青花菜的新基因。8.以‘TI-111’为试材,利用RACE技术在13个与蛋白质基因相似性较高的TDF(TDF1、TDF4、TDF5、TDF8、TDF9、TDF10、TDF13、TDF16、TDF18、TDF19、TDF20、TDF25、TDF26)上成功获得了其对应的cDNA 3′端序列。TDF与其对应的cDNA 3’端拼接后的序列已经上传到GenBank数据库中,登录号为:GR312927~GR312939。结合TDF的cDNA 3′端克隆,利用已知序列设计引物,采用荧光相对定量(相对定量)PCR技术对其中5个TDF的表达模式进行验证,结果表明,TDF4、TDF8、TDF14、TDF16和TDF20在不同温度预处理诱导的‘TI-111’小孢子RNA中的表达模式与cDNA-AFLP方法显示的结果基本一致。也证实了cDNA-AFLP差异显示技术的可靠性和准确性。