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目的CAR-T细胞治疗是一种对患者T细胞进行体外基因修饰赋予其靶向杀伤肿瘤细胞能力后进行回输治疗的过继性细胞治疗方式。本课题研究目的包括:优化原代T细胞体外扩增体系与慢病毒侵染条件;制备靶向CD19及CD20的新型纳米抗体CAR-T细胞（Nb CAR-T）与sh RNA介导的Blimp-1抑制性CAR-T细胞（sh Blimp-1 CAR-T）;探究Nb CAR-T细胞及亚精胺预处理Nb CAR-T细胞的体内外裂解B淋巴瘤细胞能力;明确sh Blimp-1 CAR-T细胞体内外清除B淋巴瘤细胞效应功能及作用机制。方法1.优化原代T细胞体外扩增体系及慢病毒侵染原代T细胞条件:通过对影响T细胞增殖,活化的细胞因子进行不同组合,利用流式细胞术,酶联免疫分析法,细胞绝对计数及细胞形态学方法,探究T细胞体外扩增最优体系;通过联合重Retronectin?、polybrene、anti-human CD3/CD28单克隆抗体、IL-2、采用荧光显微镜及流式细胞术、探究慢病毒侵染原代T细胞最佳条件;2.制备Nb CAR-T细胞并探究其生物学特征:构建CD19/CD20单靶点及双靶点Nb CAR过表达慢病毒载体,利用293T细胞包装慢病毒,浓缩纯化Nb CAR慢病毒后侵染原代T细胞,制备Nb CAR-T细胞;通过流式细胞术检测Nb CAR-T细胞阳性率、CD8/CD4比例、活化水平;Cell Trace荧光染料法及细胞绝对计数法检测Nb CAR-T增殖能力,ELISA分析Nb CAR-T细胞在Daudi,K562细胞刺激下IL-2,IFN-γ分泌情况;3.探究Nb CAR-T细胞及亚精胺预处理下CAR-T细胞的体内外抗肿瘤活性:利用流式细胞术检测不同浓度亚精胺处理下T细胞的增殖,抗凋亡能力改变情况,利用ELISA检测不同亚精胺浓度下T细胞细胞因子分泌水平,探究亚精胺预处理T细胞最佳工作浓度;构建稳定表达Luc肿瘤细胞系,荧光素酶法或LDH法检测Nb CAR-T细胞及亚精胺预处理CAR-T细胞对K562,Daudi细胞裂解能力,LDH法检测Nb CAR-T细胞对ALL患者原代肿瘤细胞杀伤能力;构建小鼠血液肿瘤模型,小动物活体成像法监测Nb CAR-T细胞及亚精胺预处理Nb CAR-T细胞体内抗血液肿瘤活性;4.分析Blimp-1与T细胞耗竭的相关性:采用TIMER2.0及TISIDB在线软件分析Blimp-1在肿瘤中的表达,与患者预后、肿瘤免疫的相关性及与TOX、NR4A、NFAT、PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、BCL-2、BCL-6、EOMES、TBET等参与T细胞耗竭基因间的相关性,探究Blimp-1对肿瘤免疫中T细胞效应功能的影响;5.制备sh Blimp-1 CAR-T细胞并对其体内外细胞毒性检测:利用sh RNA基因编辑技术下调K562细胞,T细胞中Blimp-1的表达,通过RT-q PCR,Western Blot筛选靶向Blimp-1的最佳sh RNA序列;构建Blimp-1抑制性CAR慢病毒载体,包装慢病毒,浓缩纯化后侵染T细胞,制备sh Blimp-1 CAR-T细胞;通过流式细胞术、RT-q PCR、ELISA、LDH检测Blimp-1下调后CAR-T细胞耗竭状态,即CAR-T细胞增殖潜能,细胞因子释放水平,记忆表型比例,体外细胞毒性;通过检测小鼠外周血中CAR-T细胞及肿瘤细胞存留比例,研究sh Blimp-1 CAR-T细胞体内循环情况;通过监测小鼠肿瘤负荷,生存时间,体重变化明确sh Blimp-1 CAR-T细胞体内抗肿瘤能力;6.分析sh Blimp-1 CAR-T的潜在生物学机制:利用RNA-seq数据分析sh Blimp-1CAR-T细胞表达谱,通过差异基因比较及GO,KEGG,GSEA等生物信息学分析方法,探究Blimp-1下调后对CAR-T细胞信号通路,能量摄取,参与效应功能及调控其他免疫细胞等相关基因的影响,探究sh Blimp-1 CAR-T细胞发挥抗肿瘤功能的可能潜在机制。结果1.肝素抗凝管收集的人外周血经分离纯化获得的T细胞在anti-human CD3/CD28（1μg/m L）刺激48小时,自体血浆或FBS（10%）,IL-2（200U/m L）培养体系下一周内可扩增90-100倍;T细胞在Retronectin?（20μg/m L）,polybrene（8μg/m L）,anti-human CD3/CD28（5μg/m L）,IL-2（200U/m L）存在下联合物理离心,慢病毒侵染效率最佳。2.构建的Nb CAR-T细胞具备一定生物学活性,对ALL患者原代肿瘤细胞及B淋巴瘤细胞杀伤率达60%左右;同时,经亚精胺（5μM）预处理的CD19 CAR-T及Nb CAR-T细胞体内外抗肿瘤功能均提升,细胞裂解能力增加至80%以上,血液肿瘤小鼠生存时间明显延长;Bispecific Nb CAR-T细胞肿瘤杀伤能力优于CD19 Nb CAR-T细胞及CD20 Nb CAR-T细胞。3.Blimp-1在肿瘤浸润性T细胞中高表达并参与调节T细胞耗竭;下调Blimp-1表达后CAR-T细胞TCM群体由40%提升至60%以上,抵抗细胞凋亡能力增加,促进CAR-T细胞抗原依赖性增殖及细胞毒性,同时IL-2及IFN-γ分泌水平均增加;此外,CAR-T细胞体内循环时间增加从而延长血液肿瘤小鼠生存时间;机制上,Blimp-1可能通过影响BCL-2,BCL-6等抗凋亡基因;4-1BB,TCF7等细胞干性记忆基因;PD-1,TIGIT等免疫检查点基因的表达及调节淋巴细胞增殖,细胞因子-细胞因子受体等细胞信号通路来调控CAR-T细胞耗竭状态。结论本研究优化了CAR-T细胞制备流程,获得其体外培养及慢病毒侵染的最佳体系,为进一步探究CAR-T细胞生物学功能奠定基础;CD19/CD20新型纳米抗体CAR-T细胞对ALL患者原代肿瘤细胞及B淋巴瘤细胞具高效裂解作用,表明纳米抗体应用于CAR-T细胞技术的可行性;亚精胺预处理增加了CAR-T细胞体内外抗肿瘤效应,其可作为一种提升CAR-T细胞活性的便捷措施;sh Blimp-1 CAR-T细胞通过改善CAR-T细胞耗竭状态从而提升其对B淋巴瘤细胞的体内外清除能力。