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miRNA(MicroRNA)是一类内源性短链非编码小RNA,通过翻译抑制或m RNA降解在转录后控制基因表达,参与细胞分化、增殖、凋亡及肿瘤发生等过程,在生物体内的调控机制中发挥着重要的作用。睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)除了为生精细胞提供结构支持,还能够合成并分泌乳酸,为发育中的生精细胞提供营养底物,其乳酸合成过程常常受到胰岛素等激素调控。前期研究发现温和热处理(以下简称热处理)能够提高胰岛素受体底物2(IRS2)的表达,促进PI3K/Akt信号通路活化,以提高胰岛素敏感性,但热处理促进IRS2表达的分子机制尚未明确,miRNA是否介导热处理后胰岛素刺激的支持细胞乳酸生成还有待研究。本实验首先通过TargetScan、miRWalk和MiRBase等软件及数据库预测与IRS2表达相关的miRNA,然后使用21日龄的仔猪睾丸支持细胞作为实验材料,以43°C,30min对细胞进行热处理,提取细胞总RNA,利用定量PCR技术筛选热处理后表达发生变化的miRNA。根据筛选结果,人工合成miRNA mimic与miRNA inhibitor,并在Lipofectamine 3000的介导下对HEK293T细胞进行转染,利用双荧光素酶报告基因系统进行靶基因验证。通过检测IRS2的表达,发现miRNA inhibitor能模拟热处理的作用。随后使用miRNA inhibitor转染睾丸支持细胞,转染48 h后加入100?nM胰岛素共同处理24 h,使用试剂盒检测处理后培养液中的乳酸脱氢酶活性和乳酸生成量的变化,利用定量PCR、western blotting分析miRNA inhibitor对细胞PI3K/Akt的磷酸化水平以及乳酸生成相关基因GLUT3、LDHA、MCT1的m RNA和蛋白表达的影响。试验结果如下:(1)通过TargetScan、miRWalk和MiRBase等软件及数据库预测靶向调控IRS2基因的miRNA并与猪现有的miRNA比较,筛选出7个可能的miRNAs,包括ssc-miR-96-5p、ssc-miR-142-3p、ssc-miR-7-5p、ssc-miR-142-5p、ssc-miR-133a-3p、ssc-miR-150和ssc-miR-155-5p。(2)热处理支持细胞后,仅导致ssc-miR-7-5p表达发生显著变化,与阴性对照组相比显著降低了38.2%(P<0.01)。(3)miR-7-3p mimic显著抑制了IRS2 3’UTR区的荧光素酶活性,较对照组减少43.7%(P<0.01);miR-7-3p mimic对突变型IRS2 3’UTR区荧光素酶活性无明显影响(P>0.05);转染miR-7-5p inhibitor显著提高了IRS2 3’UTR区的荧光素酶活性,比对照组增加36.5%(P<0.05)。(4)与对照组相比,热处理与miR-7-5p inhibitor均提高了IRS2的蛋白表达,分别增加了81.7%、65.4%(P<0.01),这表明,转染miR-7-5p inhibitor能够模拟热处理对支持细胞IRS2表达的调节作用。(5)mi R-7-5p inhibitor显著提高了PI3K的磷酸化水平,与阴性对照组相比,增加了52.3%(P<0.01),加入胰岛素共同处理后的PI3K磷酸化水平与抑制剂组相比进一步增加45.3%(P<0.05)。与阴性对照组相比,miR-7-5p inhibitor使Akt的磷酸化表达水平显著提高44.1%(P<0.01);加入胰岛素共同处理后Akt的磷酸化水平比抑制剂组增加了22.6%(P<0.05)。(6)miR-7-5p inhibitor提高了GLUT3、LDHA和MCT1 m RNA表达水平和蛋白表达量(P<0.05),增加了LDH的活性(P<0.01),促进支持细胞乳酸合成(P<0.01)。(7)miR-7-5p inhibitor与胰岛素协同作用后使乳酸合成相关基因的表达、LDH活性及支持细胞乳酸合成量较单独抑制剂转染组进一步提高(P<0.01)。通过以上数据分析,得出如下结论:1、IRS2是ssc-miR-7-5p在仔猪睾丸支持细胞中的功能靶基因,miR-7-5p通过与IRS2 3’UTR区结合靶向调控IRS2的表达水平。2、miR-7-5p inhibitor能够模拟热处理对IRS2的促进作用,并激活PI3K/Akt的磷酸化水平。激活的PI3K/Akt信号通路促进了GLUT3、LDHA和MCT1 mRNA和蛋白的表达,提高LDH酶活性,最终促进乳酸分泌。3、miR-7-5p inhibitor与胰岛素通过协同作用增强了IRS2/PI3K/Akt通路介导的支持细胞乳酸合成功能。综上,热处理抑制了睾丸支持细胞miR-7-5p的表达,miR-7-5p水平的下调使其靶基因IRS2的表达增加。miR-7-5p inhibitor能够模拟热处理对IRS2表达的促进作用,并与胰岛素具有协同作用,提高PI3K/Akt磷酸化水平,促进支持细胞GLUT3、LDHA、MCT1 mRNA和蛋白的表达,提高LDH活性,促进支持细胞乳酸合成。