工业酶是使用生物催化方法生产食品、医药、化工等产品的主要酶源。它们具有手性、立体异构和结构域特异性,并且具有在简单介质(如水)中而不是特定介质(如有机溶剂和其他溶液)中识别底物的能力。脂肪酶是α或β折叠水解酶,也是众所周知的蛋白拆分器。来自嗜热生物的脂肪酶能耐受高温,可用于工业生物过程。而且,这些酶的稳定性和表达可以通过将其展示在芽孢表面上来改善。芽孢展示技术效果显著,低成本,耗时少,因此是很有潜力的技术,可应用于环境、医疗和工业等行业中。芽孢能耐受恶劣的工业环境,包括耐热、耐碱、耐化学溶剂,易于回收和可再利用,因此芽孢展示技术工业中应用前景广泛。酵母菌和细菌(包括革兰氏阳性和阴性菌),是最常被用于展示各种蛋白质的载体,但与孢子不同,由于营养细胞对热、p H和化学物质敏感,易破裂。因此,芽孢是避免这些问题的最佳选择,并且相对于营养细胞展示技术,芽孢展示技术则具有多种应用领域。梭菌和芽孢杆菌的各种菌株都能形成芽孢,但是枯草芽孢杆菌最合适做展示载体,因为根据世卫组织认定它对人类是安全的,被认为是“GRAS”(通常被认为是安全的)。芽孢表面展示技术在工业、疫苗开发、环境等方面有着各种应用,细胞表面展示增强了蛋白质表达稳定性和活性,合适的连接肽会使展示的融合蛋白活性和稳定性增强。在本研究中,以海栖热袍菌和枯草芽孢杆菌染色体基因组作为模板进行PCR扩增脂肪酶Tm1350和Cot B基因,在Tm1350和Cot B之间融合了一系列具有不同长度、刚柔性和残基位置的连接肽基因,将所需基因插入大肠杆菌B.subtilis穿梭载体PHS,构建了重组质粒。将重组质粒PHS-Cot B-LxTm1350转化到枯草芽孢杆菌中并诱导芽孢形成。纯化芽孢,通过western印迹分析证实了Cot B-Lx-Tm1350的表达。检测了各种温度(40-80℃),不同p H(范围4.0-10)和不同有机溶剂对含各种连接肽的芽孢表面展示酶生物活性的影响。结果表明所有芽孢展示的融合蛋白的最适温度为75℃,L8和L10的最适p H为8.5,对于L0,L5,L6和L9,最适p H为9.0,而对于L1,L2,L3,L4和L7最适p H为9.5。在最佳温度和p H下,具有较长柔性连接肽L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)和L7(GGGGS-GGGGS-EAAAK-EAAAK-GGGGS-GGGGS)的融合蛋白具有比原始活性高1.29和1.16倍的活性。此外,在80℃下,孵育5小时后,具有连接肽L3(EAAAKGGGGS)和L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)的展示酶热稳定性最好,分别比原来的活性高1.40和1.35倍。测定了不同氨基酸残基位置取向和长度的连接肽的展示酶生物活性,其中L5,L6和L7含有30个不同氨基酸残基取向的连接肽的测定结果表明L7展示酶的活性分别是L6和L5的1.05和1.27倍。研究了0.1%蛋白酶K和菠萝蛋白酶,20%乙醇和30%甲醇对含连接肽的重组芽孢活性的影响。具有适当甘氨酸残基(柔性)的连接肽展示比丙氨酸残基(刚性)具有更高的活性。综上所述,为了提高工业过程中展示酶的活性和稳定性,通过在一定程度上优化连接肽的氨基酸残基位置取向和刚柔性,能达到改善效果。