研究背景2013年10月,诺贝尔生理或医学奖揭晓,美国2位科学家詹姆斯·罗斯曼(James E. Rothman)、兰迪·谢克曼(Randy W.Schekman)和德国科学家托马斯·苏德霍夫(ThomasC.Sudhof)因“发现细胞内的主要运输系统—囊泡运输的调节机制”,而荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。兰迪·谢克曼发现了一系列与细胞囊泡运输机制有关的基因;詹姆斯·罗斯曼发现了让这些囊泡得以与其靶点相融合的蛋白质机制,从而可以实现对所运“货物”的传递;托马斯·苏德霍夫则揭示了信号是如何实现对囊泡的控制,使其得以精确分配其所载“货物”。诺贝尔生理或医学奖奖项的授予,无疑将囊泡的研究推向了新的高潮。作为囊泡的一种,exosomes也受到越来越多的关注。1981年,Trams等在研究正常细胞和肿瘤细胞脱落小体的5’核苷酸外切酶的活性时,发现电镜下存在很多直径约40nm的囊泡,第一次发现了 exosomes。Exosomes是一种胞吞来源的、细胞分泌的粒径约40～100nm大小的膜囊泡,其中含有蛋白、DNA、RNA和脂质等。exosomes起源于内吞的多囊体,由体内各种细胞分泌。细胞经过胞吞作用形成早期内吞小体,早期内吞小体以内生出芽的方式形成多个内生小囊泡,经过内吞分选转运装置的帮助,选择性的接受胞浆内的蛋白质和脂质而形成晚期内吞小体,即多囊体。多囊体或者与溶酶体融合而被降解,或者与质膜融合,释放其中的管内囊泡,即exosomes,进入细胞间隙。Exosomes可以释放进入血液,经过血液循环而发挥作用,也可以进入局部微环境,介导细胞与细胞间相互作用。不同exosomes的功能是由其来源的细胞决定的。树突状细胞来源的exosomes参与免疫调节。病毒能够劫持宿主细胞的exosomal装置,逃避宿主的防御系统,有助于病毒转染。肿瘤来源的exosomes可以转运蛋白、mRNA和miRNA,建立一个癌性装置,有助于血管生成、细胞增生和细胞存活。Exosomes也出现在神经组织退化性疾病的传播中。尿exosomes由肾小管上皮细胞分泌,释放进入尿液,可能携带有肾脏结构和功能损伤的生物标记物。研究发现,尿exosomes中存在肾小球足细胞损伤的标记物如Podocine、podocalyxin和WT1;近曲小管损伤的标记物如megalin、cubilin、aminopeptidase N (APN)、水通道蛋白 1 (water channel aquaporin-1,AQP1)、Ⅳ型碳酸酐酶和γ-谷氨酰转移酶;Henle袢升支粗段损伤的标记物如THP、CD9和2型Na-K-2C1转运蛋白;远曲小管损伤的标记物如Na-Cl cotransporter (NCC);集合管损伤的标记物如水通道蛋白2 (water channel aquaporin-2, AQP2)、mucin-1、Rh型C糖蛋白;膀胱移行上皮细胞损伤的标记物如uroplakin-1和uroplakin-2。因此,尿exosomes分析能够为每一种泌尿系统上皮细胞的生理的和病理功能提供一个全新的认识。尿液作为一种无损伤的生物标记物来源,越来越受到人们的关注。2009年,第一个exosomes数据库ExoCarta成立,收集了很多关于尿exosomes研究的数据。由于exosomes还是一个新兴的研究领域,数据库还在逐年逐步完善更新当中。2011 年,第一个国际细胞外囊泡协会(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV, about Microvesicles, Exosomes, Ectosomes and other Extracelluar Vesicles)成立,这是exosomes研究史上的一个里程碑。近几年,每年都有举行关于尿exosomes研究的国际性学术交流会议。尿exosomes的研究已经应用于泌尿系统疾病,如慢性肾脏病、膀胱癌和前列腺癌等,也有研究报道尿exosomes可用于急性心肌梗死和非小细胞肺癌诊断生物标记物的研究。众所周知,尿液是泌尿系统及身体其他系统疾病检测中的重要标本来源。然而,尿液中含量最多的是Tamm-Hosfall蛋白(Tamm-Hosfall Protein,THP),THP多聚体能够包绕exosomes,给尿exosomes的提取带来困难。目前,关于尿exosomes提取的技术各个实验室都有自己的标准,但大部分实验技术仍有待于进一步验证,尚未发现有权威的统一的关于尿exosomes处理的标准化操作流程的研究报道。关于尿exosomes的提取技术一般有超速离心法和纳米膜浓缩法,两种方法各有各的优点和不足。文献报道的这两种方法的工作流程大都很复杂,操作起来要花费大量的时间,而且需要配备一些特殊的仪器设备。我们的研究目的是探索尿exosomes的简单有效提取技术,为临床研究提供理论依据和技术支持。糖尿病是全球范围的健康问题,特别是中国。国际糖尿病协会2012年第五版关于糖尿病流行病学资料表明,中国20～79岁糖尿病的患病人数有9230万,排在世界第一位,其次是印度和美国。重要的是一半的糖尿病患者不知道自己患有糖尿病。还有一部分人虽然没有达到糖尿病的诊断标准,但是空腹血糖受损,或者糖耐量异常,被称为糖尿病前期(Prediabetes, PreDM)。糖尿病前期可能已经有了并发症,但是还没有明显的临床表现,或者患者并不知道。根据美国1999～2006年的统计,糖尿病前期慢性肾脏病的患病率已经达到了 17.1%。因此,我们在已经建立的尿exosomes纳米膜浓缩法提取技术的基础上,对糖尿病前期、糖尿病无蛋白尿期、糖尿病肾病微量白蛋白尿期和糖尿病肾病大量蛋白尿期的尿液进行exosomes的富集,与健康对照组进行比较,试图寻找糖尿病前期和糖尿病肾病及其早期肾脏损害的生物标记物,从而为糖尿病肾病的早期诊断和干预提供依据。目的寻找糖尿病前期、糖尿病无蛋白尿期、糖尿病肾病微量白蛋白尿期和糖尿病肾病大量蛋白尿期尿exosomes中的生物标记物。方法1尿exosomes提取技术的优化我们在国内建立了两种尿exosomes提取技术:超速离心法和纳米膜浓缩法。超速离心法的操作步骤是:首先室温下相对离心力(RCF) 2000g离心30分钟,去除细胞碎片、细菌及其他杂质。其后,3.5kDa膜透析,三次更换超纯水,冷室过夜。然后,真空浓缩样品体积至原样品体积的10%。接着室温下RCF 18,000g离心30分钟,去除尿液中的污染蛋白。最后,4℃C RCF 200,000g超速离心2小时,收集尿沉渣并用超纯水重悬。纳米膜浓缩法的操作步骤是:首先,室温下RCF 2000g离心半个小时,去除细胞碎片、细菌及其他杂质。其后,自制lOOOkDa纳米膜浓缩装置,检查性能良好后,纳米膜透析浓缩样品至原体积的10%。待样品浓缩至原体积的10%左右时,加入200ml超纯水,反复冲洗纳米膜,滤过尿液中的可溶性蛋白和黄色微粒。待样品进一步透析浓缩至4～5ml时收集浓缩液。最后,4℃RCF40,000g离心1小时,收集尿沉渣并用超纯水重悬。2尿液exosome标本收集方法的优化留取健康志愿者的晨尿标本,分为15ml组和50ml组,15ml尿液标本又分为添加蛋白酶抑制剂组和不添加蛋白酶抑制剂组,50ml尿液标本又分为添加蛋白酶抑制剂组和不添加蛋白酶抑制剂组,每组各8例。纳米膜浓缩法提取尿exosomes,Bradford考马斯亮蓝法测定尿exosomes的蛋白浓度,比较各组间蛋白浓度的差异。3糖尿病及糖尿病肾病不同阶段晨尿标本的处理从珠海流行病学调查数据库中随机筛选出正常对照组、糖尿病前期、糖尿病无蛋白尿期、糖尿病肾病微量白蛋白尿期和糖尿病肾病大量蛋白尿期共75例社区居民纳入我们的蛋白组学研究,每组各15例。收集晨尿50～100ml,纳米膜浓缩技术提取尿exosomes。4尿exosomes的鉴定Bradford考马斯亮蓝法测蛋白浓度。透射电镜观察尿exosomes的形态分布,纳米颗粒跟踪分析软件观察尿exosomes的布朗运动,形态,粒径和强度。凝胶考马斯亮蓝染色观察疾病不同组的蛋白条带分布。Western blot检测尿exosomes的生成标记物TSG101。5蛋白组学研究技术在糖尿病肾病研究中的应用利用荧光差异凝胶电泳(DIGE)技术分离蛋白质,扫描分析建立图谱,通过DeCyder 2D差异分析软件,分析寻找差异蛋白。挖取与正常对照组相比较,在糖尿病前期、糖尿病无蛋白尿期、糖尿病肾病微量白蛋白尿期和糖尿病肾病大量蛋白尿期具有差异表达1.5倍以上的蛋白质,胶内酶解,进行辅助激光解析离子化-飞行时飞行时间/飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/TOF)鉴定,数据库检索,获得这些蛋白质的序列、结构和功能信息,结合文献,对感兴趣蛋白行生物信息学分析。6统计学分析SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL,USA)统计学软件被用来做统计分析。15ml和50ml添加蛋白酶抑制剂和不添加蛋白酶抑制剂所测得蛋白浓度用均值±标准差表示(μg/ml),采用析因设计方差分析对所得数据进行方差分析。对所纳入研究人群的性别、年龄、血糖、尿微量白蛋白/肌酐比值、血肌酐和尿素氮所得数据,方差齐时采用LSD法进行方差分析,方差不齐时,采用Welch方法,选择Dunnett’s T3法进行两两比较,计量资料同样采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)比较各组间的差异,计数资料采用χ2检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。结果1.与超速离心法相比较,纳米膜浓缩技术提取尿exosomes的操作步骤,具有以下优点:离心次数少,透析除杂简单,浓缩样品快,节约流程时间,普通实验室可操作,可一次性处理大量样品。2.添加和不添加蛋白酶抑制剂对尿exosomes的提取影响不大,差异不具有统计学意义(F=0.828,P<0.001)。50ml尿提取的exosomes蛋白定量显著高于15ml,差异具有统计学意义(F=58.661, P<0.001)。所纳入研究对象的疾病不同阶段的人群空腹血糖(F=28.950, P<0.001)、尿微量白蛋白尿/肌酐比值(F= 161.456, P=0.000)、血肌酐(F=3. 111,P<0.05 )、尿素氮(F=5.612, P<0.05 )、年龄(F=11.950,P<0.001),男性(χ2=32.000, P<0.001),女性(χ2=43.000,P<0.001),差异具有统计学意义。3.透射电镜下尿exosomes呈杯状或者椭圆形,分布均匀,粒径大约30～100nm。纳米颗粒跟踪分析软件分析表明,exosomes呈杯状或者椭圆形,分部均匀,布朗运动活跃,exosomes平均粒径55～llOnm。Bradford考马斯亮蓝法测蛋白浓度发现:正常对照组为15.4μg/ml,糖尿病前期为26.56μg/ml,糖尿病无蛋白尿期为51.55μμg/ml,糖尿病肾病微量白蛋白尿期为76.62μg/ml,糖尿病肾病大量蛋白尿期为89.14μg/ml。凝胶考马斯亮蓝染色显示exosomes蛋白条带显著,Western blot检测到exosomes的生成标记物TSG101阳性。4. 2D-DIGE蛋白组学和MALDI-TOF/TOF质谱技术的联合应用,共鉴定出22个差异蛋白,生物信息学分析表明,涉及到蛋白质的生物学功能有催化活性、结合活性、结构活性、酶调节活性、mRNA处理活性、转录调节活性,其涉及的生物学程序有杀伤功能、慢性炎症反应、免疫反应、信号通路、发育功能、细胞外基质的生成功能、造血功能、信号转导功能、分化功能、转运功能、代谢功能。通过蛋白质的生物信息学分析和文献检索,共筛选出4个感兴趣的差异蛋白:甘露聚糖结合凝集素丝氨酸肽酶2 (MASP2)、钙结合蛋白D28k (CALB1)、钙结合蛋白S100A8 (Protein S100 A8)和钙结合蛋白S100A9 ( ProteinS 100 A9)。结论1.本研究确定了纳米膜浓缩技术提取尿exosomes的操作步骤在尿exosomes蛋白组学研究中的应用。2. 50ml晨尿添加或不添加蛋白酶抑制剂均适合于尿exosomes的蛋白组学分析。3.糖尿病在疾病的不同时期分泌的exosomes量是不同的,随着疾病的进展,exosomes的分泌量逐渐增加,exosomes涉及疾病的发病机制和过程。4. MASP2、CALB1、Protein S100 A8 和 Protein S100 A9 可能涉及糖尿病及糖尿病肾病不同时期的转变,是糖尿病疾病进展的潜在生物标记物。创新点经国内外文献检索,尚未发现利用DIGE和MALDI-TOF/TOF质谱技术对糖尿病及糖尿病肾病不同阶段晨尿exosomes进行蛋白组学分析的研究报道。本研究所纳入的研究对象来自于横断面流行病学调查的社区居民,研究结果更加具有科学性。利用DIGE技术分离寻找差异蛋白,重复性和敏感性更好。第一次报道糖尿病及糖尿病肾病不同阶段尿exosomes中MASP2、CALB1、Protein S100 A8和Protein S100A9蛋白表达明显异常。