论文部分内容阅读
内皮素家族有三种异构体：内皮素1、内皮素2、内皮素3，其中内皮素1的生物学活性最为多样，研究也最充分。现已明确内皮素1是含21个氨基酸的活性肽，与G蛋白偶联受体A或者受体B受体结合后，可激活不同的信息通路，最终可发挥其生物学效应。研究表明，内皮素1的生物学效应非常复杂，对气道张力、离子运输、神经传递、垂体功能、基因调控等均发挥影响。最近又发现内皮素1对多种恶性肿瘤的病理发展同样具有调控作用。国外多项研究证实，恶性肿瘤组织或者培养的肿瘤细胞存在内皮素1或者受体的表达；在内皮素受体的介导下，内皮素1可以通过促进细胞增殖、抑制凋亡、促进血管生成、促进细胞周围侵润及远处转移等多种方式，促进肿瘤的发生及发展。喉癌是头颈部肿瘤中的高发疾病，占头颈部肿瘤的13.9％，我国部分地区发病率约为1.5-3.4／10万人，已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病。相对于其它恶性肿瘤，内皮素1与喉癌病理发展之间关系的研究并不充分，国外仅Shichiri等初步研究发现内皮素1可以促进喉癌细胞数量的增长，但恶性肿瘤的发生发展与细胞增殖、调亡、移行能力等密切相关，在喉癌病理发展过程中，内皮素1在上述方面的具体作用仍然缺乏深入了解，这正是本课题拟予解决的。目的1．明确内皮素1、内皮素受体在喉癌细胞中表达情况。2．了解内皮素1对喉癌细胞增殖的影响。3．了解内皮素1对喉癌细胞移行能力的影响。4．了解内皮素1对喉癌细胞凋亡的影响。方法1．RTPCR方法检测内皮素1、内皮素受体A、内皮素受体B在人喉癌HEP2细胞的基因表达；通过免疫组化ABC法研究内皮素1、内皮素受体A、内皮素受体B在人喉癌HEP2细胞爬片的蛋白表达。2．细胞种植于96孔板（2×103细胞／孔），5个浓度的内皮素1(1×10-7mol／L，1×10-8mol／L、1×10-9mol／L、1×1010mol／L、1×10-11mol／L)分别处理人喉癌HEP 2细胞，MTT方法检测24小时、48小时、72小时、96小时的吸光度，观察内皮素1能否促进细胞增殖。3．按300个细胞／孔密度，将HEP2细胞接种于24孔板，3个浓度内皮素1(1×10-7mol／L、1×10-9mol／L、1×10-11mol／L)干预细胞48小时后，继续培养10天，观察克隆生成情况。4．按3×105细胞／孔密度，将HEP 2细胞接种于6孔板，3个浓度内皮素1(1×10-7mol／L、1×10-9mol／L、1×10-11mol／L)分别处理细胞48小时，采用划痕实验方法观察内皮素1对喉癌细胞移行能力的影响。5．3个浓度内皮素1(1×10-7mol／L、1×10-9mol／L、1×10-11mol／L)分别处理细胞24、48小时后，观察喉癌细胞凋亡指数的变化。结果1．人喉癌HEP2细胞采用内皮素1、内皮素受体A、内皮素受体B和GAPDH引物进行PCR，均获得阳性目的片断，与预期片断长度符合。内皮素1扩增片断长度为129bp，内皮素受体A扩增片断长度为175bp，内皮素受体B扩增片断长度为130 bp，GAPDH扩增片断长度为141bp。2．光学显微镜下观察，人喉癌HEP 2细胞浆内见内皮素1棕黄色免疫反应颗粒沉着；内皮素受体A、内皮素受体B亦见免疫阳性反应，免疫反应主要分布于细胞膜。3．MTT法显示，1×10-7mol／L浓度内皮素1作用喉癌HEP 2细胞后，可以明显促进喉癌HEP 2细胞增殖，而1×10-11～1×10-8mol／L浓度组的内皮素1对喉癌细胞HEP 2的增殖没有作用。4．内皮素1干预喉癌HEP 2细胞48小时，并继续培养十天后，内皮素1(1×10-7mol／L浓度)处理组细胞集落体积大，细胞克隆数为59.0±2.00；1×10-9mol／L浓度组克隆数为32.6±1.15，1×10-11mol／L浓度组克隆数为30.6±2.08，对照组为31.0±1.00。内皮素1(1×10-7mol／L浓度)组与对照组比较，有显著性差异。5．1×10-7mol／L、1×10-9mol／L、1×10-11mol／L浓度内皮素1处理细胞48小时后，明显促进喉癌HEP 2细胞的移行，其中对照组移行细胞数为8.00±1.00，内皮素1各处理组(1×10-7mol／L、1×10-9mol／L、1×10-11mol／L)分别为21.6±1.57、17.3±1.52、15.6±2.08，与对照组比较，各个内皮素1浓度组均有显著性差异。6．流式检测显示，内皮素1处理24、48小时后，各内皮素1浓度组与对照组、各内皮素1浓度组间细胞凋亡率（AI）均无显著性差异。结论1．人喉癌HEP 2细胞存在内皮素1、内皮素受体A和内皮素受体B基因及蛋白表达。2．内皮素1可以促进人喉癌HEP2细胞增殖，并且与内皮素1的浓度高低相关。3．内皮素1对人喉癌HEP 2细胞移行有促进作用。4．内皮素1对人喉癌HEP 2细胞的凋亡没有影响。