【摘 要】
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目的孤独症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍疾病,对患者的家庭和社会造成了巨大的经济压力,预计至2030年占国家GDP的1%。目前缺少有效的临床诊断生物标志物。一氧化氮（NO）是一类具有神经毒性和神经保护双重作用的自由基,研究发现亚硝酸盐和硝酸盐总浓度（NOx）在ASD患者血液中偏高,而在尿液、唾液中浓度未知。为了探索新型无创检测的生物标记物,本研究精确检测与分析了ASD儿童尿液、唾液中NO水平
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目的孤独症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍疾病,对患者的家庭和社会造成了巨大的经济压力,预计至2030年占国家GDP的1%。目前缺少有效的临床诊断生物标志物。一氧化氮（NO）是一类具有神经毒性和神经保护双重作用的自由基,研究发现亚硝酸盐和硝酸盐总浓度（NOx）在ASD患者血液中偏高,而在尿液、唾液中浓度未知。为了探索新型无创检测的生物标记物,本研究精确检测与分析了ASD儿童尿液、唾液中NO水平,主要采用了以下研究方法:方法（1）评估一氧化氮检测仪化学发光法（Nitric Oxide Analyzer Chemiluminescence,NOA）的准确度、精密度、检测限、定量限及稳定性。通过平行比较多种已知的前处理技术,优化尿液亚硝酸盐（NO2-）、硝酸盐（NO3-）的预处理方法。通过观察尿液NO2-、NO3-稳定性与时间与温度的关系,明确最佳储存温度和时间。然后采用NOA法精确检测140个ASD儿童、140个正常发育（normally developing,ND）儿童及102个健康成年人尿液中NO2-、NO3-的水平。（2）采用p H计测量尿样p H值在不同温度、保存时间的变化。（3）通过平行比较多种已知的前处理技术,优化唾液前处理方法。通过观察吐法取样、棉签取样与优化的前处理过程（氢氧化钠+离心法）对唾液中亚硝酸盐稳定性的影响,明确取样及前处理方法。然后采用NOA法精确检测ASD儿童、ND儿童、健康成年人唾液中亚硝酸盐的水平。结果（1）NOA法检测标准样时,NO2-、NO3-检测限分别是0.03μM、0.02μM,且定量限分别是0.11μM、0.07μM,相对标准偏差均<5%,回收率的范围在97.7%～107.5%。表明NOA法检测NO2-、NO3-准确、可靠。（2）对尿液的各种前处理方法比较发现,各种化学物质或过滤操作均导致样本结果的不稳定,因此采用不处理、直接向NOA反应器注射尿样进行检测。此外,虽然尿样在-20℃下可稳定保存3 h,仍需及时检测。（3）通过对成人一天13 h样本的多次检测发现,尿液NO2-、NO3-在13 h中并无显著波动规律。此外,通过观察4天内运动前后尿样,发现运动降低尿液中NO2-、NO3-的水平。（4）ASD儿童、ND儿童、健康成年人尿液中NO2-浓度分别为1.0710±0.1849、0.3706±0.0377、0.4965±0.0418μM,NO3-浓度分别为2.9280±0.1898、2.350±0.1122、3.5800±0.2587 m M。ASD儿童尿液中NO2-、NO3-水平明显高于ND儿童,p值分别为0.0003、0.0094。健康成年人尿液中NO2-、NO3-水平明显高于ND儿童,p值分别为<0.0001、0.0002。（5）性别并未造成尿样中NO2-、NO3-水平的差异。（6）棉签取样在ASD儿童、ND儿童、健康成年人唾液采集中可行。唾液被氢氧化钠+PBS法处理后,在-20℃下至少可稳定保存24 h,且棉签取样不影响唾液中NO2-的检测。（7）ASD儿童、ND儿童、健康成年人唾液中NO2-的浓度分别为6.3410±0.5308、1.5770±0.1188、1.2560±0.0741μM。与ND儿童比,ASD儿童唾液中NO2-水平显著偏高（p<0.0001）,健康成年人的显著偏低（p=0.0069）。（8）性别并未造成唾液样本中NO2-水平上的差异。结论ASD儿童唾液、尿液中NO2-水平显著高于ND儿童,表明NO可能是ASD诊断的潜在氧化应激生物标志物。
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