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多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种极易复发的致命性造血系统恶性肿瘤,复发后中位生存期仅为5年左右。细胞毒性化学药物治疗、硼替佐米等新型药物治疗、造血干细胞移植等治疗手段虽然延长了患者的中位生存期,但均不能有效解决MM治疗后复发的难题。MM复发和耐药与MM细胞群中存在少量的癌干细胞(cancer stem cells,CSCs)有关。CSCs具有自我更新、多向分化潜能和显著的多药耐药特性,常规治疗药物因未瞄准MM CSCs,无法从根本上控制其增殖与复发。CSCs膜上高表达一种药物外排泵蛋白(ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2),其属于ATP结合蛋白转运体家族的第二个成员,广泛存在于正常组织,在机体内承担着一定的生理功能,但在MM等多种恶性肿瘤CSCs中ABCG2表达显著增高,是CSCs耐药的重要标志,可将多种抗癌药物如米托蒽醌、阿霉素等泵出细胞外,ABCG2与CSCs的强耐药特性密切相关。微泡是通过膜壳包裹一定气体形成的包膜微气泡(microbubble,MB)结构,多采用脂质或生物可降解聚合物制成,作为一种新型药物传输载体,具有微泡壳膜安全性高、可通过多种方式携载药物、载药能力强以及超声击破微泡引起的各种生物效应可提高药物传输能力等多种优点。更重要的是,微泡联合超声辐照可实现被动靶向性治疗,将抗肿瘤特异性抗体耦联在载药微泡表面,则可进一步实现主动靶向性治疗。因此,微泡联合超声在恶性肿瘤的治疗方面具有重要应用价值。蒽环类药物表阿霉素(epirubicin,EPI)是临床常用的抗肿瘤化疗药,广泛用于MM、乳腺癌、肉瘤等多种恶性肿瘤。EPI普通剂型不具有肿瘤靶向性,用药后在非肿瘤组织也有较多的分布,导致消化道反应、骨髓抑制、肝肾毒性等各种不良反应,心脏毒性是其剂量限制性毒副反应,显著限制了其临床应用。为解决MM复发、耐药及EPI毒副作用大等问题,本研究以免疫磁珠分选法从人MM细胞系中获得MM CD138-CD34-CSCs,以此为靶标,制备结合ABCG2单抗(mAb)的载EPI脂质微泡,通过mAb靶向高表达ABCG2的MM CSCs,在超声作用下靶向MM释药,以提高肿瘤局部的EPI药物浓度,降低化疗毒副反应;为此,利用结合ABCG2单抗的载EPI脂质微泡体外及荷MM的非肥胖糖尿病/严重的联合型免疫缺陷(nonobese diabetic/severecombined immunodeficient,NOD/SCID)鼠模型研究,探讨该策略对MM的作用效应及其相关机制。目的:探讨结合ABCG2单抗的载EPI微泡联合超声,靶向CSCs治疗MM的效应及其机制,为提高MM患者的疗效、减少复发率及最终根治MM提供新思路、新方法。方法与内容:1.分选与鉴定MM CSCs:采用免疫磁珠分选技术,从人MM细胞系RPMI8226中筛选出表型为CD138-CD34-MM细胞,按课题组先前采用的方法,分别通过体内外实验,重复确证CD138-CD34-MM细胞具有CSCs特性。2.靶向载药微泡的制备与表征:利用生物素-亲和素法将ABCG2mAb与载EPI微泡相结合,制备EPI-MBs+mAb,检测其抗体结合情况和粒径、zeta电位、载药率等理化性质,研究该微泡与MM CSCs的体外靶向结合能力及超声干预下靶向细胞释药能力。3.体外细胞抑制与杀伤实验:实验分PBS对照(Control)组、载EPI微泡(EPI-MBs)组、载EPI微泡靶向MM(EPI-MBs+mAb)组、EPI组、EPI联合超声(EPI+US)组、载EPI微泡联合超声(EPI-MBs+US)组、载EPI微泡靶向MM联合超声(EPI-MBs+mAb+US)共7组。观察不同实验组药物对MM CSCs体外抑制与杀伤效应;并从MM CSCs线粒体膜电位和细胞周期的改变、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9凋亡相关蛋白的表达水平以及透射电镜观察细胞超微结构变化,分析其抗MM CSCs的效应及机制。4.经皮下注射MM CSCs建立MM模型体内治疗实验I:用免疫磁珠分选法从人MM细胞系RPMI8226分离的1 × 106CD138-CD34-细胞,经皮下注射至NOD/SCID鼠。取适量EPI-MBs+mAb和EPI-MBs静脉注入成瘤后鼠体内,病理组织学及超声成像法观察EPI-MBs+mAb对皮下移植瘤的靶向性。将荷瘤鼠随机分为PBS对照(Control)组、EPI组、载EPI靶向微泡(EPI-MBs+mAb)组和载EPI靶向微泡联合超声(EPI-MBs+mAb+US)共4组,每组3只。观察不同实验组尾静脉给药对荷瘤鼠的治疗效应,应用免疫组织化学、HE染色、TUNEL法等病理学方法和Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、TopoisomeraseⅡα 的 Western blot 检测分析其抗 MM CSCs效应及机制;实验重复1次。5.经尾静脉注射MM CSCs建立MM模型体内治疗实验Ⅱ:用上述方法分离的5 ×106 CD138-CD34-细胞经尾静脉注射至NOD/SCID鼠,约21天后,通过骨密度、肾损伤和尿蛋白动态监测方法,分析鉴定建立荷MMNOD/SCID鼠模型。制备CY7.5标记的EPI-MBs+mAb和EPI-MBs,尾静脉注入荷瘤鼠体内,近红外荧光活体成像法动态观察两种微泡的体内肿瘤靶向性。荷瘤鼠分组情况同体内治疗实验I。观察不同实验组尾静脉给药对荷瘤鼠的治疗效应,并应用细胞学、病理组织学及影像学等技术,探讨其靶向CSCs治疗MM效应及机制。结果:1.RT-PCR、Western Bolt及流式细胞术(FCM)结果显示,免疫磁珠分选获得的CD 138-CD34-MM细胞(MM CSCs),其ABCG2分子表达水平显著增高,与非CD138-CD34-MM细胞(Non-CSCs)比较,差异有统计性意义(P<0.05或P<0.01);CCK8法、软琼脂克隆形成、Transwell实验结果表明,CD138-CD34-MM CSCs的增殖活性、体外克隆形成能力、细胞迁移和侵袭能力以及在NOD/SCID鼠体内致瘤能力均比Non-CSCs显著增强,差异有统计性意义(P<0.05或P<0.01)。2.制备的载药微泡靶向MM表征结果显示,EPI-MBs+mAb分散性好、粒径均一、稳定性好、载药率较高,与MM CSCs靶向性结合能力强,超声干预下可靶向RPMI8226细胞释药。3.体外实验结果显示,与对照组比较,EPI-MBs组和EPI-MBs+mAb组无明显抑制MM CSCs增殖效应,其他组则有不同程度的抑制效应,以EPI-MBs+mAb+US组的效果最强。FCM检测发现,抑制效应与凋亡率的实验结果相吻合。Western blot结果表明,EPI-MBs+mAb+US 显著提高 cleaved Caspase-3 和 cleaved Caspase-9 表达,而对诱导凋亡的Caspase-8分子表达无明显影响。4.经皮下注射1×106CD138-CD34-细胞至NOD/SCID鼠,约18天可形成肿瘤;EPI-MBs+mAb在体内能很好的靶向聚集到皮下移植瘤组织并停留较长时间,且具有超声成像功能。与对照组比较,EPI组、EPI-MBs+mAb组和EPI-MBs+mAb+US组都可不同程度的抑制肿瘤体积、延长荷瘤鼠生存期,其中EPI-MBs+mAb+US组,治疗效应最明显。肿瘤免疫组化及Western blot结果表明,EPI-MBs+mAb+US组,能显著促进Caspase-3、Caspase-9、Bax表达,而抑制Bcl-2、增殖细胞核抗原(proliferating cellnucleaantigen,PCNA)、Topoisomerase Ⅱα表达,与其他各组相比,效应最强,差异有统计性意义(P<0.05或P<0.01)。肿瘤组织HE染色、TUNEL检测结果表明,EPI-MBs+mAb+US组,较其它各治疗组能显著诱导MM CSCs凋亡,差异有统计性意义(P<0.05或P<0.01)。5.经尾静脉注射注射5× 106CD138-CD34-MM CSCs约21天后,与正常组比较,模型组鼠出现了降低骨密度、溶骨性损害、肾损害和蛋白尿,表明尾静脉注射MM CSCs已成功建立荷MM NOD/SCID小鼠模型。近红外活体荧光成像显示,与EPI-MBs组相比,EPI-MBs+mAb能更好的靶向聚集在脊柱、四肢等肿瘤病灶部位。与模型组比较,各治疗组均能不同程度地减轻荷瘤鼠的骨损害、肾损害以及贫血等症状,差异有统计性意义(P<0.05或P<0.01),其中,以EPI-MBs+mAb+US组疗效最明显。结论:1.EPI-MBs+mAb+US通过mAb特异的靶向MMCSCs,部分阻断ABCG2药泵活性,在超声干预下释放EPI,发挥其持久抑制MM生长和诱导MM CSCs凋亡;此外,抗体和补体介导的细胞毒效应也可能发挥一定作用。2.EPI-MBs+mAb在荷MM NOD/SCID小鼠体内对MM CSCs具有良好的靶向性,联合超声干预能产生较强的抗MM效应,这为清除MM CSCs、根治MM提供了新的策略。