microRNA是由约22个核苷酸序列组成的内源性非编码的RNA分子,通过与靶mRNA分子的3’UTR区域内作用位点结合程度的不同来抑制靶mRNA翻译或者介导靶mRNA的降解,正因为这种作用使得它们成为机体内基因表达的主要调控者。研究表明:人体内具有数以百计的miRNA分子,而一个miRNA分子能同时调控多个靶基因,经研究人体内约三分之一的基因均受miRNA的调控。在中枢神经系统中蕴含着丰富的miRNA表达基因,其中很大一部分miRNA的功能多样性与神经元基因的表达相关。miRNA几乎与所有的生物进程相联系,如分化、死亡、凋亡、炎症等,与此同时miRNA的表达也受某些特异性的酶及表观遗传的调控。研究表明,许多的疾病如癌症、炎症等均与miRNA的非正常性表达密切相关。研究表明在非神经元的宫颈癌细胞(Hela cells)中过表达miR-124,细胞内mRNA表达谱向神经元模式转变;在中枢神经系统的发育阶段,miR-124不仅可下调PTBP1基因的表达来促进神经系统的发育,而且还诱发了下游总的神经系统特异性的选择性剪接。类似的,在室管膜下层区域,miR-124可作为决定神经命运的关键因素同时也参与成年神经元的再生。不仅如此,最近一项研究发现,在神经元分化的过程中miR-124能调节神经细胞突起生长和延伸。同时有文章报道miR-124可通过抑制ROCK1的表达来促进神经突起生长,但是miR-124具有同时调控多个基因表达的功能,而且神经突起生长是一个相当复杂的过程,因此miR-124促进突起生长的靶基因及其作用机制仍然值得我们继续去研究。1980s年,氧化固醇结合蛋白OSBP在仓鼠的肝脏细胞质中首次被纯化和鉴定出来,该蛋白位于人类和小鼠的11号染色体上。氧化固醇结合蛋白OSBP与OSBP相关蛋白ORPs在真核生物中构成一个保守的固醇和磷脂酰肌醇结合蛋白家族。研究发现,该家族主要与脂质调控、固醇生成、载体生成及细胞信号转导密切相关,现被认为是固醇和磷酸肌醇介导细胞胆固醇体内平衡的的反馈感应器。然而,OSBP在中枢神经系统中的作用到目前为止研究的比较少。组蛋白去乙酰化酶HDACs是具有从组蛋白或者非组蛋白的乙酰基上移除乙酰基团能力的一类酶。根据其进化的保守性,哺乳动物的HDACs可分为三类:第一类为与酵母RPD3蛋白同源的HDACs-1、2、3、8和11,该类酶存在于细胞核;第二类 HDACs 包括 IIA(HDACs-4、5、7)和 IIB(HDACs-6 and 10),该类酶经外界信号刺激后可在细胞质与细胞核之间穿梭,但HDAC10除外;第三类为与酵母SIR2同源的sirtuin蛋白。近期研究表明:HDAC4的表达可能受miRNA(如 miR-129a、miR-365 等)调控。经 TargetScan 软件预测发现 HDAC4的3’UTR中有miR-124的靶序列,但HDAC4是否受miRNA124的直接调控,到目前为止还未知。由于miR-124调节突起生长作用的直接靶基因及其机制还未完全为人所知,因此我们对miR-124促进神经突起生长作用的直接靶向基因进行筛选。首先,我们运用生物软件TargetScan,对候选基因OSBP进行在线预测。发现OSBP 3’UTR上含有4个保守的miR-124作用位点。为了探究OSBP是否是miR-124直接作用的靶基因,我们将其3’UTR克隆入双荧光载体psiCHECKTM-2中,而后将miR-124过表达质粒hU6-hsa-miR-124-CMV-GFP(U6-124)及其两个对照质粒 hU6-scrambled-CMV-GFP(U6-124mut)和 hU6-hsa-CMV-GFP(U6)分别与OSBP 3’UTR共转入HEK293细胞中。结果显示,miR-124过表达质粒(U6-124)与OSBP 3’UTR共转的荧光素酶活性显著低于OSBP 3’UTR和U6共转染的对照质粒组;而当OSBP基因的3’UTR中的miR-124的靶位点突变后("GTGCCUU",划线部分的核苷酸突变为"CGG")再与miR-124过表达质粒(U6-124)共转,发现其荧光素酶活性与OSBP 3’UTR质粒和U6-124共转染的质粒组相比显著增高。说明miR-124能直接作用于OSBP3’UTR。接下来我们探究miR-124对内源性OSBP表达的影响,我们将miR-124过表达质粒hU6-hsa-miR-124-CMV-GFP(U6-124)及其对照质粒 hU6-scrambled-CMV-GFP(U6-124mut)分别转染HEK293细胞,发现miR-124过表达后,OSBP的蛋白表达量是显著降低的。以上结果提示我们OSBP可能是miR-124直接作用的靶基因。接下来我们对miR-124的另一候选靶基因HDAC4进行筛选。同样在HDAC4 3’UTR中发现有四个保守的miR-124作用位点,荧光素酶活性实验也表明HDAC4 3’UTR与U6-124共转的荧光素酶活性显著低于HDAC4 3’UTR与U6共转染的对照质粒组;然而,当HDAC4 3’UTR中miR-124靶位点突变后再与U6-124共转,此时荧光素酶活性与HDAC4 3’UTR质粒和U6-124共转的质粒组相比显著增高。同时我们也观察到在HEK293细胞中过表达miR-124,内源性HDAC4的蛋白表达量是显著降低的。表明:HDAC4可能是miR-124直接作用的靶基因。研究发现,在小鼠大脑发育过程中随着发育的成熟miR-124的表达量逐渐升高,在胚胎期14天及17天表达最强,出生后处于高表达状态。为研究miR-124与OSBP的表达水平的相关性,我们采用了不同的方法来研究不同发育阶段C57老鼠(胚胎期第14天、第18天、出生后第1天、第7天、第14天、第21天、第4周、第6周、第8周)的皮层脑组织中OSBP基因表达水平变化。RT-PCR结果表明,在发育过程中,出生后第1天的OSBP的mRNA表达量与胚胎期18天相比无显著差异,而出生后第7天、14天、21天、4W、6W、8W的OSBP mRNA表达量与胚胎期18天相比显著降低(P<0.000);同样用聚丙烯酰胺凝胶电泳发现OSBP的蛋白表达量在出生后21天、4W、6W、8W显著低于胚胎期18天(P<0.000),而出生后第1、7、21天相对于胚胎期18天的OSBP蛋白水平无显著变化;取4W和8W的大脑皮层切片做免疫荧光,也发现8W的老鼠OSBP蛋白表达量较4W的老鼠是降低的。以上结果表明OSBP表达量的变化与miR-124在大脑发育过程中的变化趋势呈负相关的。前面我们已经发现OSBP可能是miR-124直接作用的靶基因,而已有研究报道miR-124具有促进神经突起生长和延伸作用,因此下一步我们将探究OSBP基因在神经突起生长中的作用。首先我们采用的是shRNA介导基因沉默的方法。选取文献中可有效干扰OSBP表达的两个片段,将其序列送去基因公司合成shRNA干扰质粒。命名为shOSBP-1、shOSBP-2及其打乱序列的对照质粒shcontrol。首先我们对干扰质粒的有效性进行验证,将OSBP过表达质粒(OSBP-Tomato)分别与 shOSBP-1、shOSBP-2 及其对照质粒 shcontrol 转染HEK293细胞,96h后提取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果显示,shOSBP-1、shOSBP-2均有效,但shOSBP-2干扰OSBP基因表达的效果更好。接下来我们检测OSBP基因下调对N2a细胞的神经突起生长的影响。将shRNA-1及其对照质粒shcontro丨分别转染N2a细胞,24h后用荧光显微镜观察细胞突起形态,统计结果显示,转染shOSBP-1质粒的N2a细胞神经突起长度显著长于对照质粒shcontrol组。提示我们,OSBP基因下调显著促进N2a细胞的神经突起生长和延伸。研究表明在神经母细胞瘤细胞系P19中过表达miR-124具有促进神经突起生长的作用,为研究OSBP是否影响miR-124诱导的促神经突起生长作用,首先我们检测miR-124在神经母细胞瘤N2a细胞模型中是否也具有促进神经突起生长的作用。我们将miR-124过表达质粒(U6-124)及其对照质粒(U6)转染N2a细胞并用20μmol视黄酸来诱导细胞分化,24h后用荧光显微镜观察细胞形态。结果显示miR-124过表达后神经突起长度显著高于对照组,且突起长度大于两倍胞体长度的细胞数目占全部细胞总数的百分比也显著高于对照质粒组。这提示我们,miR-124在N2a细胞模型中同样具有促进神经突起生长和分化的作用。接下来为探究OSBP在miR-124诱导的促神经突起生长中的作用,我们在N2a细胞中过表达OSBP。将miR-124过表达质粒(U6-124)分别与OSBP过表达质粒(OSBP-Cherry)或空载体质粒(pmCherry-N1)共转染N2a细胞,经20μmol视黄酸诱导分化24h后用荧光显微镜观察细胞形态。结果发现U6-124与OSBP-Cherry共转染组的N2a细胞的神经突起长度显著低于U6-124与pmCherry-N1对照质粒转染组,差异具有统计学意义。这提示我们,OSBP在miR-124促进N2a细胞神经突起生长的模型中,具有抑制突起生长的作用。为更进一步的研究OSBP对突起生长的影响,我们在原代培养的神经元中也进行了研究。我们同样采取shRNA诱导基因沉默的方法,将shOSBP-2及其对照质粒shcontrol用电转的方法转染原代培养的皮层神经元,分别在48、72h观察神经元形态。统计结果显示,转染shOSBP-2质粒后的48h、72h两个时间点的神经突起长度均显著高于对照组shcontrol。提示我们在原代培养的皮层神经元中下调OSBP可促进神经突起生长。为更进一步确定OSBP对突起生长的抑制作用,我们用电转染的方法将OSBP过表达质粒pmCherry-OSBP及其对照空载体质粒pmCherry-N1分别转染原代培养的皮层神经元,分别在48、72、96h观察神经元形态并统计大于两倍胞体的神经元突起长度。结果显示,转染OSBP过表达质粒pmCherry-OSBP组在48h、72h和96h三个时间点的皮层神经元突起长度均显著低于转染对照质粒pmCherry-N1组,提示我们OSBP过表达抑制神经突起生长。以上结果均表明OSBP在原代培养的神经元突起生长中起着重要作用。同时我们也对HDAC4基因与神经突起生长关系进行探究。将miR-124过表达质粒(U6-124)分别与HDAC4过表达质粒(HDAC4-Tomato)或其对照质粒(td-Tomato)共转染N2a细胞,结果显示,miR-124与HDAC4-Tomato共转后,N2a细胞的神经突起长度与miR-124和对照质粒td-Tomato的共转染组之间没有差异。表明在N2a细胞模型中,HDAC4过表达不影响miR-124诱导的神经突起生长作用。综上所述,本课题首次发现OSBP及HDAC4基因可能是miR-124直接作用的靶基因,miR-124通过与OSBP及HDAC4基因的3’UTR结合来下调其表达;在N2a诱导分化模型中,miR-124具有促进神经突起生长的作用,OSBP能抑制miR-124的促神经突起生长作用,而HDAC4不影响miR-124的促神经突起生长作用。在N2a及原代培养的皮层神经元中下调OSBP显著促进神经突起生长,而在原代培养的皮层神经元中过表达OSBP具有抑制神经突起生长的作用。