RNA干扰为治疗人类疾病提供了一个很有前景的方法。前期已有一些学者对于RNAi抗HBV做过研究,但是每个研究小组设计的siRNA分子对病毒的抑制效果有明显的差异,因此还需在HBV的干扰靶点上做大量的工作；另外大多研究进行的都是siRNA的瞬时转染,未构建稳定的转染体系,不能观察清除HBV RNA的远期效果；目前临床应用的抗病毒药物也都需要进行长期治疗,包括干扰素、核苷酸类似物,RNA干扰的作用亦需持久。病毒基因突变是RNA干扰抗病毒失败的重要原因,针对病毒可逃逸RNAi作用的特点,我们设计了可在体内同时表达两个microRNA,靶向不同位点的串联序列amiRNA。即便是病毒一个基因位点的突变就可以逃逸siRNA,而并不能逃逸miRNA的干扰作用。miRNA在体内之所以能广泛存在并发挥作用,是因为它的特点是只要骨架与靶RNA相同,单一一个位点的变化不会影响其发挥作用。目前对于乙肝病毒的研究已从最初的化学合成siRNA、shRNA质粒载体等向应用性较强的microRNA的研究过渡。尽管有学者用化学合成的多个siRNA同时作用于一个细胞,证实了靶向多个区域基因的可行性,但其为剂量依赖性的,需经常向体内注入siRNA。通过质粒等载体在细胞内表达miRNA或siRNA不仅经济方便,还可进行稳定转染,使小干扰RNA持续表达,延长对目的基因的抑制时间。质粒载体能介导更长期的干扰效果,而过多的质粒载体可能对细胞造成一定的影响。串联序列表达载体的优点就在于只需导入一个质粒载体就可发挥作用。amiRNA使得导入的外源性基因在体内自然形成miRNA成为可能,并可同时表达多条miRNA。有学者利用polⅡ启动子表达多个串联的shRNAs,从而抑制了多个基因的表达,其对应蛋白的表达都有明显降低。但有研究提出siRNA可诱导IFN反应,从而存在一些安全性问题。相对于siRNA,由polⅡ启动子介导的amiRNA技术被证实不会引起宿主的免疫反应,亦没对miRNA的内源性途径产生影响,安全有效。有研究采用该种方法将2个串联序列amiRNA导入细胞,但未取得更好的干扰效果,可能是因为并没有找到最佳的干扰序列。另外,关于串联序列amiRNA在HBV DNA水平的干扰效果,尤其是cccDNA方面的干扰效率未见报道。HBV是一个DNA病毒,但必须经过前基因组RNA进行逆转录,使得RNA干扰得以发挥作用,临床中HBV DNA的检测更为实用。cccDNA是HBV的源泉,使得对它的观察更为重要。因为其半衰期较长,所以稳定转染更能接近临床研究情况。目的：本文结合以往研究的经验,针对HBV容易变异的特点,力图寻找针对HBV基因组保守区域的多个有效干扰位点；将构建的质粒瞬时转染入HepG2.2.15,检测各个序列在RNA水平对HBV的干扰效率；挑选干扰效果好的序列,优化设计并构建针对不同位点的串联序列amiRNA表达载体；通过瞬时转染和稳定筛选,全面研究单一序列及串联序列amiRNA表达载体在抑制HBV RNA、DNA和蛋白质表达及cccDNA方面的效果。方法：1.针对病毒容易变异而逃逸RNAi作用的特点,我们首先利用生物信息学软件找到不同基因型HBV基因的保守区域,避开临床常见的病毒变异位点选取4个HBV的RNAi靶位点,分别靶向HBV的S区或X区。2.利用microRNA设计软件,设计4条microRNA序列,并构建四个以CMV为启动子的内源性miR155为骨架的amiRNA表达质粒,分别命名为amiHBV-1、amiHBV-2、amiHBV-3和amiHBV-4。3.将构建成功的4个amiHBV表达载体分别瞬时转染到含有HBV-DNA全基因的人肝母细胞瘤HepG2.2.15细胞株,从mRNA水平研究单一序列amiHBV对HBV mRNA干扰效果,筛选干扰效率高的amiRNA序列,将其中2条干扰效率较高的单一序列串联,构建串联序列amiRNA表达质粒(amiHBV-3-4)。4.将串联序列amiHBV表达质粒瞬时转染入HepG2.2.15细胞,因为ami-HBVI和ami-HBV2在HBV mRNA水平的抑制效率低,在下一步的实验中将其舍去。采用实时定量荧光PCR法分别检测细胞培养上清液和细胞内的HBV DNA；采用CMIA法(Chemiluminescent Microparticle Immunoassay)定量检测分泌蛋白HBsAg和HBeAg的水平变化。5.通过转染后稳定细胞株的筛选,建立amiRNA稳定转染的HepG2.2.15细胞株,采用荧光实时定量检测试剂盒,对amiRNA干扰HBV的复制根源cccDNA的效果进行了研究。结果1.本研究中4个不同靶位的amiRNA载体被构建,4个单一序列及1条串联序列amiHBV表达载体均经测序验证构建成功。2.4个单一序列amiHBV表达质粒以amiHBV-4对HBV mRNA的抑制率最高可达75.6%, amiHBV-3对HBV mRNA的抑制率为61.2%；而amiHBV-1和amiHBV-2对HBVmRNA的抑制率仅为29.3%及14.9%；其中串联序列amiHBV 3-4的干扰效率为87.2%,串联序列组的干扰效率高于单一序列组。3.各组质粒对培养细胞上清中HBV DNA的干扰效率以串联序列质粒组最高可达到94.3%,单一序列组中干扰效率最高的分别为amiHBV-3组60.5%和amiHBV-4组68.0%。对细胞内HBV DNA的干扰效率amiHBV-3组、amiHBV-4组和amiHBV 3-4组分别为71.6%、80.2%和79.7%。4.在转染后72h对细胞上清中HBsAg的抑制效果最好的为串联序列组达到67.4%,其次为amiHBV-4组达到64.6%,再次为amiHBV-3组。对HBeAg的抑制总体效果不及对HBsAg的抑制效果好,串联序列组抑制效果最好,但也只达到了31%。稳定转染后两组(amiHBV 3-4和amiHBV-4)对HBsAg和HBeAg的分泌,均显示了显著的抑制效果。对HBsAg的抑制率最高达97.18%,对HBeAg的抑制率最高达97.00%。5.对HBV cccDNA的干扰情况进行了研究,瞬时转染amiHBV-4组对HBV cccDNA的抑制率为21.9%,串联序列amiHBV3-4组的抑制率(58.4%)明显高于单一序列组。稳定转染后串联序列组HBV cccDNA的抑制率为99.65%,单一序列组的抑制率为93.78%。结论：1.分别靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp位点的单一序列amiRNA对HBV RNA、DNA和表面抗原(HBsAg)均有显著的干扰效果。2.同时靶向HBV S区基因256-276bp和672-692bp两个位点的串联序列amiRNA对HBV RNA、DNA和HBsAg的干扰效果均显著优于单一序列HBVamiRNA的干扰效果。3.瞬时转染靶向HBV S区的串联序列amiRNA对HBsAg的抑制效果显著,对HBeAg的抑制不明显；稳定转染串联序列amiRNA对HBsAg和HBeAg均有显著的抑制效果。4.稳定转染的单一序列或串联序列amiRNA对HBV DNA、cccDNA、HBsAg及HBeAg的抑制效果均优于瞬时转染的抑制效果。5.针对HBV S区基因的单一序列或串联序列amiRNA对HBV RNA、表面抗原(HBsAg)、DNA及cccDNA均有较好的干扰效果,提示HBV S区基因是RNA干扰的有效靶点之一。6.串联序列amiRNA介导的RNA干扰机制能极大程度的抑制HBV的复制、病毒蛋白的表达及复制根源cccDNA。7.本研究串联两个靶位点的amiRNA表达质粒构建成功并显示高效的抗病毒功能,提示针对多个靶基因或靶位点的amiRNA载体的构建和功能的实现具有可行性。