一、研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC）0157:H7是一种食源性人畜共患肠道病原微生物,可导致食物中毒,引起人和动物严重的腹泻、出血性肠炎（haemorrhagic colitis,HC）、溶血性尿毒综合症（Haemolyticuraemic syndrome,HUS）、血栓性血小板减少性紫瘢（thromboticthromobocytopenic porpura,TTP）等。EHEC 致病主要通过 stx 基因编码的Stxl和Stx2毒素,因此这类细菌也被称为产志贺样毒素大肠埃希菌（Shiga-toxin producing E.coli,STEC）。1983 年,EHEC 0157:H7 引起的出血性结肠炎首次在美国暴发流行,是由美国学者Riley等首次从快餐引起的严重出血性腹泻患者粪便中分离出了 EHEC 0157:H7并确认为一种新的致泻性大肠埃希菌。此后,由EHEC 0157:H7引起的散发病例和小型暴发在世界范围内不断发生。1999年美国华盛顿发生了一起由EHEC0157:H7感染引起的116人的食物中毒,1982-2002年间就有350起,疫情遍及49个州,共8598人感染,其中1493例（17.4%）住院治疗,354例（4.1%）为溶血性尿毒综合症,40例（0.5%）死亡。1996年5-8月,日本大坂府堺市的学龄儿童中突然暴发一起EHEC 0157:H7感染,历时3个月,波及40多个都府县,患者达9000余人,死亡11人,创有史以来最高发病记录,引起全世界的关注。2006年美国25个州发生了因食用被污染的新鲜菠菜而导致的200多人食物中毒事件,罪魁祸首也是0157:H7。我国自1986年首次分离0157:H7以来,全国多地有暴发,规模比较大的是1999年在江苏淮北部分地区及邻近的安徽部分地区发生的该菌感染,患者超过2万人、死亡177人、流行长达7个月,被认为是迄今为止世界范围内规模最大、死亡人数最多、发病原因最复杂、时间最长的一次。目前,0157:H7的暴发和流行时有发生,已成为全球性的公共卫生问题。EHEC 0157:H7的致病性主要体现在黏附性和毒素两个方面。黏附性主要依赖其黏附分子—紧密黏附素（Intimin）,由eae基因编码,定居于肠道,引起黏附和抹去（A/E）损伤。毒素主要是致贺毒素（Stx）,是一种能够确定EHEC特性的主要毒力因子,分为Stxl和Stx2两种,这种毒素兼具有神经毒性、细胞毒性和肠毒性三种活性。其一方面直接杀死肠绒毛的上皮细胞;另一方面,由Stx引起的肠上皮损伤以及LPS、炎性因子能促进Stx穿越肠上皮细胞进入血液循环造成一些器官如肾脏的损伤。研究表明,Stx是导致HC和HUS的主要致病因子,Stx可导致肾细胞严重的超显微形态学变化,引起细胞凋亡,而细胞凋亡可导致HUS的发生。志贺毒素还具有血小板凝集的功能,可损伤内皮细胞,这可能与患者发生TTP有关。稳定期是大肠杆菌与入侵相关毒力基因表达的关键时期,大多数入侵人体的大肠杆菌都是稳定期的的细菌,与细菌稳定期的活动密切相关的polyP及其合成关键酶基因ppk引起了人们的关注。PPK即多聚磷酸盐激酶（PolyphosphateKinase）,由ppk基因编码,是由687个氨基酸组成的同源二聚体,每个亚单体约80kDa,含有四个结构域,是可逆性的催化ATP的磷酸盐末端聚集产生多聚磷酸盐（polyphosphate,polyP）的重要的酶。PPK包含PPK1和PPK2,PPK1仅存在于部分微生物,还有许多微生物中不仅有PPK1,还有PPK2。PPK2具有两个与PPK1显著不同的特征,一是PPK2能够利用polyP合成GTP,且主要是合成GTP。另一个特征是它们对鸟苷酸和腺苷酸的选择性:PPK2利用G,TP或ATP合成polyP的活性类似,而PPK1只能利用ATP合成polyP;PPK2能够利用polyP合成GTP或ATP,然而PPK1利用polyP合成ATP的能力相当于合成GTP能力的30多倍。大肠埃希菌中只含有PPK1,本文中所说的PPK指的是PPK1。首先PPK1自磷酸化是合成多聚磷酸的第一步。它的活性位点位于一个保守的通道内,该通道内有一个特异性的ATP结合口袋,可以可逆的将ATP的Y磷酸基转移到多聚磷酸的末端。由数百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合形成的多聚体即为polyP,广泛分布于自然界的每个细胞中,包括细菌、真菌、植物、动物。polyP具有多种生物学功能,包括:参与能量代谢,维持细胞形态,调节胞内酸碱度和渗透压以及细胞磷脂膜通道的形成等。在大肠埃希菌中,ployP诱导rpoS基因即RNA聚合酶σ因子基因的表达。RpoS是稳定期特异性的RNA聚合酶σ因子,它参与了稳定期超过500个基因的表达调控,涉及致病菌的毒力及氧化压力、高渗、热敏、近紫外辐射、乙醇、酸性pH和其它一些尚未明确的压力适应性调控。有PPK突变的大肠埃希菌,当严紧应答和胁迫应答时有稳定期适应缺陷,甚至死亡,表明多聚磷酸盐在大肠埃希菌稳定期的应答中起着必不可少的调节作用。研究表明,polyP可以通过cAMP受体蛋白影响稳定期调节因子RpoS的表达,来参与致病力的调控。ppk基因缺失,polyP合成减少,RpoS的表达也明显下降,而与RpoS调控相关的一些基因表达也会下降。EHEC 0157:H7作为致病菌已发现30多年了,我们依然没有找到合适的治疗方法。尽管EHEC0157:H7对抗生素敏感,但是受抗生素攻击的细菌会释放志贺毒素,导致溶血性尿路综合征（HUS）恶化。抗动力治疗的疗效差,因为它可使EHEC0157:H7持久存在,不断表达毒性。口服免疫抗原易被胃肠道分泌的胃酸消化,而粘膜疫苗对机体的保护力度不够。研究PPK1结构的科学家建议可以把多聚磷酸盐合成中的ATP结合口袋作为PPK1抑制剂研究的一个靶标,该抑制剂可以阻断PPK1二聚体之间的相互作用,而它们之间的相互作用对保持PPK1的活性又是必须的,一旦阻断,PPK1就会失去活性,进而影响多聚磷酸盐的合成和一些相关基因的表达,更进一步影响大肠埃希菌的生物功能和感染能力,从而达到治疗大肠埃希菌感染的目的。通过大鼠、小鼠和人类基因组序列分析,又与真核生物涉及磷酸代谢的酶序列进行Blast比对,高等真核生物体内均未发现有ppk基因或PPK同源序列,因此将ppk基因或PPK1作为抗生素作用靶点的治疗可能是一种较好的EHEC 0157:H7的治疗方法。虽然PPK在其他一些病原体中的部分功能已见报道,比如polyP和PPK可能参与核苷酸的代谢,polyP作为ATP的替代品的应用和能量来源,polyP在SOS调节基因中的干预,polyP影响RpoS的表达等,但是否在0157中也有作用仍旧未知。鉴于0157对人类健康造成的威胁性,研究PPK1在其中的作用对研究0157的致病机制和药物治疗具有重要意义。本研究运用Red重组系统构建了EHEC 0157:H7 EDL933w 菌株的 ppk基因缺失株（EHEC 0157:H7 EDL933w△ppk）,同时研究比较了野生株、缺失株的生物学功能,运用实时荧光定量PCR（RT-PCR）比较了野生株、缺失株、回补株三种菌株稳定期调节基因rpoS、毒力基因stx1和stx2的mRNA表达水平,初步探索了 polyP和PPK在大肠埃希菌中的作用,为后续进一步的研究奠定了基础。二、研究方法1.肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株与回补株的构建根据GenBank的ppk基因序列（Accession NO.NC₀02655）及其上、下游的DNA序列,设计合成三对引物:其中H1-K1、H2-K2为含同源臂的引物,引物的5’端与ppk基因上下游部分序列同源,3’端与卡那霉素抗性基因部分序列同源;PPK-P1、PPK-P2,N1-F、N2-R 分别为 EHEC 0157:H7ppk基因的交叉鉴定引物;另Kana-F、Kana-R为pKD4质粒内kana抗性基因的内部鉴定引物。以质粒pKD4为模板,H1-K1、H2-K2为引物PCR扩增出卡那抗性片段,将扩增出的kana抗性片段电转入含有pKD46的EHEC 0157:H7 EDL933w的感受态细胞中,利用Red同源重组系统,由kana抗性片段替换待敲除的ppk基因,通过卡那抗性的平板筛选出阳性菌株,经过PCR、测序结果验证。利用pMD19T质粒做载体,以ppk外部引物P1、P2扩增回补的基因片段,切胶回收并和载体连接,化转入ppk基因缺失株内,通过氨苄抗性平板筛选出阳性菌株,PCR和测序验证。2.野生株与突变株生物学特征的比较革兰染色:各取一环野生株和缺失株菌液于载破片上,均匀涂成一层薄膜,干燥,固定,按革兰染色步骤染色:初染-媒染-脱色-复染,干燥后,光学显微镜油镜下观察。细菌生长曲线:从新鲜涂布的平板上挑取单菌落静置培养过夜,1:100接种到新鲜的LB培养基,190r/min,37℃培养,依次测定Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h的OD600值,以时间为横坐标,OD600的对数为纵坐标,绘制各生长曲线。细菌黏附实验:处于亚融合状态的Lovo细胞经胰酶消化后,调整浓度为1.5×105cells/well,接种至含有处理过的盖玻片的6孔细胞培养板内,37℃,5%C02培养箱中培养24h,生长汇合至单层。将过夜培养的EHEC 0157:H7 EDL933w野生株和缺失株细菌悬液以100:1的感染倍数加入细胞孔内,重复3孔,同时以不加菌液的细胞孔板为阴性对照,37℃,5%C02培养箱内孵育2h。用1×PBS冲洗细胞爬片3遍,4%多聚甲醛溶液固定20min,Gimsa染色液染色15min,水洗2～3遍,待干,倒置显微镜下镜检。3.PPK/polyP对EHEC 0157:H7 EDL933菌株稳定期调节基因rpoS及重要毒力基因stx1和stx2表达水平的影响为了检测ppk基因敲除是否对稳定期调节基因rpoS、毒力基因stx1和stx2表达有影响,我们用sybrgreen荧光染料法进行RT-PCR,比较了野生株、缺失株及回补株之间的rpoS、stx1、stx2基因相对表达量。三、结果1.构建了 EHEC 0157:H7 ppk基因缺失株（EHEC 0157:H7 EDL933w△ppk）和回补株用引物H1-K1、H2-K2,PCR扩增出了 kana抗性片段,大小约为1577bp,电转入含有pKD46的EHEC 0157:H7 EDL933w的感受态细胞中,用含有kana抗性的LB固体培养基筛选发生重组的细菌,经ppk内部鉴定引物验证,缺失株中无目的条带,野生株中可见到一条大小约为430bp片段。测序证实,菌株EHEC 0157:H7 ppk基因（2067bp）完全缺失。2.野生株与缺失株生物学特征比较结果革兰染色中,野生株和缺失株均为革兰染色阴性,短小棒状杆菌。根据所测的OD600绘制生长曲线,野生株和缺失株的生长曲线趋势基本一致。采用吉姆萨染色定性观察EHEC 0157:H7菌株对Lovo细胞的黏附情况,可见野生株黏附于细胞的数量较多,缺失株较少。3.用内参基因GAPDH标化后,对荧光定量PCR（相对定量）的结果进行统计学分析,运用公式计算2-△△ct,pp 基因缺失株rpoS、stx1和stx2基因的2-△△Ct明显低于野生株和回补株。四、结论1.运用Red重组系统成功构建了ppk基因缺失株,在缺失株的基础上又构建了ppk基因回补株,为后续实验打下基础。2.ppk基因的缺失不影响EHEC 0157:H7的形态和生长规律。细菌黏附实验结果显示缺失株和野生株对细胞的黏附能力能力不同,ppk基因缺失株对细胞的黏附能力较弱,提示ppk基因与细菌的黏附力相关。3.运用荧光定量PCR对rpoS基因和stx1、stx2基因进行相对定量分析,结果表明ppk基因敲除导致polyP产量减少,可导致稳定期调节基因rpoS及重要毒力基因stx1和stx2的表达水平下调。