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无乳链球菌是奶牛乳房炎的致病菌之一,患有乳房炎的奶牛会影响牛奶的产量和品质,目前奶牛乳房炎的主要治疗手段是使用抗生素疗法,但抗生素易使细菌产生耐药性,影响治疗效果。中草药具有不易产生耐药性、高效低毒、低残留的优势。因此本研究对20味中药的有效成分进行提取,筛选出抗无乳链球菌最优的中药,对其单味中药进行提取工艺的优化,在最佳提取工艺条件下,研究黄连提取物对引致奶牛乳房炎的主要致病菌的体外抑菌活性,然后以抑菌效果最优的中药有效成分的单体物质为研究对象,进行抗无乳链球菌的抑菌机理的初步研究。主要研究内容如下：1抗无乳链球菌中药的筛选：采用乙醇回流法和超声波法提取20味中药的有效成分,测定黄连等20味中药提取物对无乳链球菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration, MBC)。20味中药提取物的体外抗菌活性结果表明：黄连、虎杖、地榆和黄芩4味中药提取物的MIC值和MBC值范围为78mg/mL～15.625mg/mL;蒲公英、乌梅、茵陈、秦皮、艾叶和紫花地丁6味中药提取物的MIC值范围为3125mg/mL～62.5mg/mL, MBC值范围为62.5mg/mL～125mg/mL;黄柏、鱼腥草和白头翁3味中药提取物的MIC值和MBC值均为125mg/mL;苦参、金银花、穿心莲、杜仲、连翘、夏枯草和何首乌7味中药提取物的MIC值和MBC值范围为25 0mg/mL～500mg/mL。结论：筛选出黄连提取物对无乳链球菌具有最好的体外抑菌效果。2黄连抗无乳链球菌的最优提取工艺及体外抑菌活性研究：采用正交设计,以浸膏得率及对无乳链球菌的最低抑菌浓度(MIC)值和最低杀菌浓度(MBC)为指标,对黄连提取工艺条件进行优选研究,在黄连的最佳提取工艺条件下,测定黄连提取物对奶牛乳房炎的主要致病菌即无乳链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值。最佳提取工艺结果表明,黄连的最佳提取工艺为料液比1：8,80%乙醇浓度回流提取2次,每次1.5h。黄连体外抑菌活性实验结果表明,黄连提取物对无乳链球菌的MIC值和MBC值均为39mg/mL,对大肠杆菌的MIC值和MBC值分别为62.5mg/mL和125mg/mL,对金黄色葡萄球菌的MIC值和MBC值均为3125mg/mL。结论：在最佳提取工艺下的黄连提取物抑菌效果提高,且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有一定的抑菌作用。3盐酸小檗碱对无乳链球菌形态结构及乳酸脱氢酶活性的影响：利用平板稀释法绘制出盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线,通过透射电子显微镜观察盐酸小檗碱对无乳链球菌超微结构的影响,测定乳酸脱氢酶(LDH)活力研究盐酸小檗碱对无乳链球菌酶活性的影响。抑菌曲线结果表明,在MIC浓度下,盐酸小檗碱能够抑制细菌的生长；在2MIC浓度下,盐酸小檗碱能在4h内将细菌全部杀死。透射电镜结果表明,正常组无乳链球菌细胞结构清晰完整,从内到外可见层次分明的核区,细胞膜和细胞壁。在盐酸小檗碱的作用下,细胞形状变得不规则,细胞膜、细胞壁逐渐溶解,膜壁界限变得模糊,细胞质严重外流,核区不清晰,细胞质解体内出现空腔。测定酶活力实验结果表明,经过药物作用后,乳酸脱氢酶活力下降。结论：盐酸小檗碱对无乳链球菌的抑菌曲线呈现了浓度时间的相关性。盐酸小檗碱对无乳链球菌的结构有较强的破坏作用,随着时间的延长破坏加剧,且可以降低乳酸脱氢酶的活性。4盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响：通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验和4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核酸荧光染色法研究盐酸小檗碱对无乳链球菌蛋白质和DNA的影响。SDS-PAGE结果表明,正常无乳链球菌蛋白谱带多且清晰,而经药物作用后,蛋白谱带变浅,有的谱带甚至消失；DAPI染色实验结果表明,正常无乳链球菌DNA荧光强度较强,且荧光点较多,经过药物作用后DNA荧光强度明显减弱。结论：盐酸小檗碱可以影响蛋白质和DNA的合成。