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目的：
1.本研究通过直接测序中国汉族人群线粒体基因组来发现和分析其多态性位点并绘制变异频谱。
2.筛选变异频率较高的线粒体单核苷酸多态性(SNP)位点,确定是否可作为中国人群的正常参照位点,以期修订中国汉族人群自己的线粒体标准序列。
3.根据不同年龄段对线粒体编码区和控制区的多态性分析,为群体遗传学、法医学、癌症及遗传性疾病、衰老及线粒体DNA生物芯片等提供可靠详尽的信息。
方法：
1.标本收集:随机选取2008年12月-2009年2月期间于温州医学院附属第一医院检验中心和温州医学院2009年入学新生体检465例汉族人,其中男性211人,女性254人,收集体检人群的新鲜外周全血标本和相关的临床资料。
2.用DNA提取试剂盒提取所有外周血标本的全基因组DNA。
3.PCR扩增:采用覆盖整个线粒体基因(mtDNA)且具有重叠序列的24对引物进行PCR扩增,直接测序后应用Chromas、Condone Code Aligner、DNAStar等分析软件与剑桥参考序列(revised Cambridge Reference Sequence,rCRS)进行比对。
4.寻找中国人群特有的线粒体多态性位点,比较中国汉族人群与其他不同群体线粒体多态性的差异。筛选变异频率较高的编码区和控制区8个SNP位点:mt8701(ATP6)、mt9540(CO3)、mt10400(ND3)、mt10873(ND4)、mt12705(ND5)、mt14668(ND6)、mt14783(CytB)、mt16189(D-loop区)分析其在中国汉族人群中的多态性。分析不同年龄段人群线粒体多态性的分布差异。
结果：
1.通过对465例中国汉族人群线粒体全基因组测序分析,共发现1542个位点上有16647个碱基发生变化。其中344个位点为线粒体核苷酸多态性(SNP)位点。223个位点为www.mitomap.org和mtDB(www.genpat.uu.se/mtDB/)中尚未报道的新变异位点。
2.发现有11个位点变异率极高,分别为 A8860G100.0％、A4769G99.57％、G11719A99.35％、A73G98.94％、A750G98.92％、A2706G98.92％、A15326G98.06％、A263G97.42％、C7028T96.99％、A1438G95.91％、C14766T93.98％。有11个位点变异率在45％以上,分别是A10398G57.85％、C12705T55.48％、C16223T55.05％、A8701G49.46％、C10400T49.46％,T10873C49.46％、G15301A49.25％、T9540C48.82％、G15043A47.31％、T14783C46.45％、T489C45.59％。
3.在CO2/tRNALys之间9bp(CCCCCTCTA)发现3种多态:缺失型90例,插入型1例,野生型374例,缺失率为19.35％。
4.在线粒体控制310区共发现309insC213例,309insCC78例,315insC429例,315insCC6例。
5.在线粒体514-523位置(CA)n重复多态性位点发现(CA)32例,(CA)4149例,(CA)5314例,无(CA)6、(CA)7、(CA)8型。
6.结合编码区和控制区8个SNP位点分析:该人群有40个单体型,19个单体型概率为0.274％。该正常人群遗传变异度值为h=87.9％,人群单倍体型偶合概率为p=12.30％。
7.线粒体突变数目与性别关系不大,在增龄过程中无发现线粒体突变累积趋势。但发现18个线粒体多态性位点G3010A、A4715G、C5178A、C8414T、T9824C、A10398G、C10400T、T10609C、T10873C、G12406A、C12882T、C14668T、G15043A、G15301A、T16092C,C151T、A663G、T16217C的变异频率与增龄存在相关性。
结论：
1.本研究发现223个未报道的新变异位点,可以为建立更完善的系统树提供指标。2.8860G、4769G、11719A、73G、750G、2706G、15326G、263G、7028T、1438G、14766T等位点可以考虑为中国汉族人群特有的位点,有助于建立中国汉族人群自己的线粒体标准序列。
3.CO2/tRNALys之间发生9bp(CCCCCTCTA)缺失型90例,插入型1例,野生型374例,缺失率为19.35％,表明了中国汉族人群的9bp缺失频率由南向北呈现一个递减的梯度分布。本实验显示,基本符合此趋势,进一步支持了中华民族南方起源的观点。
4.在线粒体控制310区309insC/CC变异率为62.5％,315insC/CC变异率为98.8％。结合A73G(98.92％)、C16223T(55.05％)、T16352C(32.90％)分析:亚洲人群之间差异较小;而16362和73位变异点上,亚洲人群与白人及非洲人群差异较大,认为是亚洲人群明显的人类学特征;在16223位变异点,亚非人群均较白人高出许多,有研究认为这些差异是由于mtDNA的高进化率所引起。
5.在线粒体514-523位置(CA)n重复多态性位点发现(CA)32例,(CA)4149例,(CA)5314例,基因差异度(GD)为0.4408,与其他人群存在明显差异,在法医学鉴定中有一定的应用价值。
6.结合编码区和控制区的多态性位点可以对人群进行更准确的单体型分析,只有不断扩大mtDNA的检测范围,才能发现更多的mtDNA遗传标记,从而提高个体识别能力。
7.线粒体突变差异在性别中无相关性,突变累积在增龄中无累积趋势。15个线粒体多态性位点G3010A、A4715G、C5178A、C8414T、T9824C、A10398G、C10400T、T10609C、T10873C、G12406A、C12882T、C14668T、G15043A、G15301A、T16092C的变异频率在增龄过程中呈渐增趋势,3个线粒体多态性位点C151T、A663G、T16217C的变异频率在增龄过程中呈递减趋势。