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线粒体是真核细胞的能量代谢中心,线粒体基因组的不稳定会导致线粒体氧化磷酸化与ATP合成障碍,引起线粒体功能失调,进一步影响细胞的能量代谢、自由基的产生和细胞凋亡等过程。SLS1(Sigma Like Sequence)位于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)第十二号染色体的421543到423474,系统名称为YLR139C,开放阅读框全长1932bp,编码一个有643个氨基酸残基的线粒体蛋白,相对分子量为73.2kDa,等电点为10.02。研究报道Slslp通过Namlp协调mtDNA的转录及翻译过程。本实验室前期发现敲除SLS1后导致酵母菌株在甘油培养基上生长缺陷,线粒体氧化磷酸化活性和ATP产量显著下降,8种mtDNA基因(COX1, COX2, COX3、ATP6、 ATP9、 CYTB、15S rRNA和21S rRNA)含量均显著下降,且下降程度各不相同。SLS1恢复表达与过表达后,这8种mtDNA基因含量均有不同程度增加。以上结果表明SLS1与mtDNA的稳定性密切相关,可能与mtDNA直接作用或与其他线粒体拟核相关蛋白作用影响mtDNA稳定性,但目前有关SLS1影响mtDNA稳定性的机制尚不明确,Sls1p与其他线粒体拟核相关蛋白相互作用未见报道,并且没有形成商品化的Slslp抗体。本文将构建Slslp表达质粒,表达、纯化蛋白,制备单克隆抗体,为研究Slslp相互作用蛋白及调控线粒体基因组稳定性机制奠定基础。本文利用PCR技术体外扩增酿酒酵母SLS1,通过Not I与SalI酶切位点将其与质粒载体pET28a连接,构建pET28a重组质粒(pET28a-SLS1).将重组质粒转入E. coli BL21(DE3)中,得到可以启动T7promoter表达目的蛋白(Slslp)的表达菌。通过诱导温度、IPTG浓度、诱导时间的优化,得到表达菌的最佳诱导条件：37℃,0.4mmol/L IPTG诱导4h。对表达产物的分析发现,Slslp在菌体内主要以包涵体形式存在,在细胞破碎后的沉淀中,目的蛋白约为54%。包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解后,经Ni+亲和层析柱分离纯化,透析脱盐后的蛋白以絮状沉淀形式析出,用2mL PBS重悬后经SDS-PAGE凝胶电泳胶密度面积扫描法测定蛋白浓度和纯度,蛋白浓度达到2.5mg/mL,纯度为88.3%。制备单克隆抗体,通过Western Blot检测初步制备的抗体,目前已在免疫小鼠的血清中检测到抗体,也已筛选出分泌抗体的杂交瘤细胞株,但信号较弱,需进一步筛选和制备。抗体的制备将为研究Sls1p相互作用蛋白及调控线粒体基因组稳定性机制奠定基础。