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目的酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase,ASMase)是鞘磷脂/神经酰胺(ceramide,Cer)信号通路的关键酶,在细胞产生Cer的过程中起着至关重要的的作用;Cer主要以生物活性鞘脂的形式存在于细胞,在内皮细胞中高度富集,可对多种细胞应激作出反应,在许多生理和病理过程中起着重要作用,目前,对于癌症的研究Cer是前沿话题。脂多糖(即革兰氏阴性菌的内毒素,由磷脂-多糖-蛋白质复合物组成,LPS)当给与一定浓度的剂量刺激时可诱导肺癌细胞凋亡,但其中所涉及的分子机制尚不清楚。在此,我们研究了ASMase的作用和ASMase/Cer通路在LPS诱导的人肺腺癌细胞(pc9、A549)凋亡中的作用,为肺癌甚至各种肿瘤的治疗提供新的临床思路。方法1.使肺腺癌细胞pc9和A549暴露于不同浓度的LPS(200,150,100,50,10和0μg/ml)处理24,36和48小时,通过CCK-8凋亡试剂盒,选取适当的诱导细胞凋亡的适宜的浓度和时间。2.给予细胞不同浓度的丙咪嗪(imipramine,IM,酸性鞘磷脂酶抑制剂)处理,CCK-8法检测细胞活力,选取浓度最大但对细胞本身伤害无意义的IM浓度。3.对细胞进行分组处理,用0、150μg/m L LPS、20μmol/L IM+150μg/m L LPS、20μmol/L IM处理pc9和A549细胞36小时后,进行了Hoechst凋亡染色,观察细胞和细胞核形态变化。4.将pc9和A549两种细胞暴露于0、150μg/m L LPS、20μmol/L IM+150μg/m L LPS、20μmol/L IM后,采用逆转录-聚合酶链反应(简称RT-PCR,全称Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)技术检测凋亡信号调节激酶1(Apoptosis Signal Regulating Kinase 1,ASK1)半胱胺酸天冬氨酸蛋白(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)和ASMase的前体信使核糖核酸(messenger Ribonucleic Acid,m RNA),利用蛋白免疫印迹(Western blotting,WB),ASK1,ASMase,Caspase-3和裂解的半胱胺酸天冬氨酸蛋白(cleaved-Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,cl-Caspase-3)。5.用0、150μg/m L LPS、20μmol/L IM+150μg/m L LPS、20μmol/L IM处理细胞36小时后,使用免疫荧光技术分析Cer的表达水平。6.对两种细胞单独给予不同浓度的Cer(80,60,40,10 and 0μmol/L)暴露时长分别为12,24和36小时,CCK-8法观察细胞活力值(OD)变化,Hoechst凋亡染色观察不同Cer浓度下细胞凋亡变化,筛选出恰当的Cer浓度。7.用0和60μmol/l的Cer浓度分别处理两种细胞,采取RT-PCR和WB法检测细胞中ASK1,Caspase-3和cl-Caspase-3 m RNA和蛋白质的变化情况。结果1.随着LPS浓度和暴露时长的增加,细胞的存活率在逐渐降低,与对照组比较细胞活力明显降低细胞存活率为70%左右,故而选取出150μg/m L的LPS处理时长为36小时;从处理结果可以看出IM浓度范围在0~20μmol/L时对细胞无明显毒性,故选定20μmol/L的处理剂量。2.与不加药组相较ASK1,ASMase,Caspase-3和cl-Caspase-3的m RNA和蛋白质LPS处理组的表达均明显升高(P<0.01),IM组无明显变化(P>0.05);而LPS加入抑制剂IM共孵育组与相应的LPS处理组相比,表达水平显著被抑制(P<0.01);细胞凋亡染色结果呈现同样的趋势变化。3.从免疫荧光染色结果可以看出,与对照组相较LPS组Cer表达明显增多(P<0.01),IM组无明显变化;而抑制剂加LPS组与LPS组相比Cer的表达显著被抑制(P<0.01)。4.从CCK-8和凋亡染色的结果来看,当两种细胞pc9和A549暴露于不同浓度的Cer处理组,伴随着时间梯度的增加,细胞凋亡的数量显著变多,细胞存活率明显下降。5.与对照组相比Cer组的ASK1,Caspase-3和cl-Caspase-3三种蛋白质和相应的m RNA表达水平均明显上调(P<0.05)。结论LPS诱导肺腺癌细胞pc9和A549凋亡,凋亡相关蛋白ASK1,Caspase-3和cl-Caspase-3,ASMase和Cer表达均增加,这说明其中必然涉及到ASMase和Cer的参与,详细的机制仍需待进一步的探究。但总的来说这些结果至少表明了ASMase/Cer通路在LPS诱导的肺腺癌细胞pc9和A549凋亡中起着重要作用。