背景：大肠癌包括结肠癌和直肠癌,是指大肠黏膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变,好发于直肠与乙状结肠交界处。消化系统常见的恶性肿瘤大肠癌,也是全世界常见的恶性肿瘤之一,在我国,大肠癌的发病率在消化道肿瘤中仅次于胃癌和食管癌,其发病率位于世界肿瘤发病率的第三位。随着人们生活条件和饮食习惯的改变,大肠癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势,死亡率已位居恶性肿瘤第5位。根据世界卫生组织2004年的统计,在全球排名前20的死亡原因中大肠癌排名第20位,我们推测至2030年大肠癌排名上升到第14位。大肠癌的真正病因虽然尚未明确,但是对其发病的危险因素已经有较深入的研究大肠癌的高危因素主要有以下几个方面：1)饮食因素,2)遗传因素3)大肠息肉、炎症性肠病等,这些疾病大肠癌发病率明显增加4)吸烟、饮酒。5)幽门螺旋杆菌6)社会心理因素,长期精神压抑、环境不适应、不能自我调节不良情绪、焦虑和应激反应强等C型行为模式认为是癌症的易感行为模式。大肠癌被认为是多因素、多阶段,各种分子事件发生发展而形成的。这些因素可归纳为内源性及外源性2大类：外因包括理化与生物源性因素,内因包含遗传或获得性的基因不稳定,微卫星不稳定以及染色体不稳定。总的来说,肠癌的发生与基因突变,以及蛋白质、酶水平变化及其翻译修饰中磷酸化乙酰、化或糖基化作用有关。这些失调现象的积累,导致了肠癌的发生。因此有必要揭示与理清这些过程中基因突变及蛋白的失调的原因,为进一步研究肠癌的发生发展机制,为临床上治疗提供新的靶点。锌指蛋白是在哺乳动物细胞内含量第一的蛋白质模体,是多种特异性DNA结合蛋白质中最大的一个类别。这些锌指蛋白与真核基因的表达调控密切相关,它们是一类重要的调控因子,参与肿瘤的发生,发展,转移等诸多过程。而其中的RING指结构域是一种蛋白质相互作用区域,普遍有2方面功能：1,可参与基因转录调控、DNA修复和重组、细胞转化及肿瘤抑制等多种生物过程；2,RING指结构域是E3泛素蛋白连接酶的重要活性区域,许多含有RING指结构域的蛋白在泛素途径中起关键作用。泛素化-蛋白酶体系统(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)是真核细胞内重要的蛋白质质控系统,是细胞内ATP依赖的蛋白质选择性降解的主要途径,细胞内80%--90%的蛋白通过泛素.蛋白酶体途径降解。UPS参与调节炎症、细胞增生与分化、细胞内信号转导、细胞周期进程、转录调控、抗原剃呈、免疫应答、细胞凋亡和DNA修复等各种细胞学功能。当泛素蛋白酶体系统识别特异性底物的基因序列发生功能性突变时,其对靶蛋白的调控能力可以引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白异常降解、突变细胞凋亡受阻和增殖加速,导致肿瘤的发生。RN181是一个新的C3H4型锌指蛋白,基因全长716个碱基,编码153个氨基酸的蛋白,这个蛋白还有一个RING指结构域。2008年Brophy等人首次证实RN181具有E3泛素连接酶的活性。而E3酶通过泛素多聚化,在蛋白酶体降解蛋白的底物特异性中起到决定性的作用,作为UPS的关键蛋白E3酶的异常,在疾病包括癌症的发生、发展中起到一个重要作用。本课题组的前期实验发现,RN181可以通过ERK/MAPK途径抑制肝癌细胞HepG2、SMMC7721的生长。提示RN181能参与调节肝癌细胞的发生,发展过程。但是关于RN181对于别的肿瘤的生物学功能的研究非常少,尤其是对大肠癌的研究更是一片空白。因此,本研究以我国多发的大肠癌为研究对象,通过分子生物学实验、免疫组织化学技术、细胞学实验、等现代常用实验技术,对RN181在大肠癌中生理功能及其作用机理进行研究。目的：1明确在临床结肠癌组织中RN181的表达情况及其与结肠癌发生发展的关系。2,明确在野生结肠癌细胞中RN181的表达。3,沉默RN181的重组结肠癌细胞系的构建。4,探索RN181在结肠癌细胞生长方面的具体生物学作用并研究其作用机制。方法：1,采用免疫组织化学染色的方法,分析在93例临床结肠腺癌组织中,RN181的表达量与临床结肠癌发生、发展的关系。2,荧光定量RT-PCR与Westerblot实验鉴定RN181在野生型结肠癌细胞中本底表达量。3,将购买的RN181(上海吉玛公司提供)干扰慢病毒感染结肠癌sw1116、 RKO、ht29、sw480、sw620五种细胞,通过RT-PCR与Western blot实验方法鉴定后,扩大培养、冻存。4,用CCK-8实验方法检测稳定干扰RN18的肠癌细胞系的增殖状况,同时用平板克隆形成实验检测重组结肠癌细胞的体外克隆形成能力,用裸鼠皮下接种成瘤的方法观察重组结肠癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力。5,体外细胞Western Blot检测RN181可能参与调节的信号通路。结果：1,在93例临床标本中,免疫组化染色方法结果显示,RN181在大肠癌组织高表达而在相应癌旁组织低表达。在癌旁组织中,RN181的表达与年龄、性别、病理分级、临床分期和肿瘤大小的差异无相关性。而在癌组织中,RN181的表达量与性别、病理分级、不同大小的肿瘤中差异也没有相关性。RN181表达量与临床分期的差异存在统计学意义,具体为随着肠癌就逐渐进入中晚期,RN181的表达量呈梯度上升。在生存期分析中癌组织中高表达RN181的病人,中位生存时间与5年生存率均明显低于RN181低表达的肠癌病人。2,RN181在野生型的肠癌细胞中的表达没有规律性。3,成功构建了稳定干扰RN181的结肠癌细胞株。用表达RN181干扰片段的重组慢病毒感染sw480、sw620、ht29、sw1116、RKO细胞系。Real-Time定量PCR(P<0.05)和Western Blot检测结果表明,转染后细胞中RN181的表达量明显减少,提示成功构建了稳定干扰RN181的细胞。4,采用CCK8法与平板克隆实验检测稳定干扰RN181的重组大肠癌细胞系与其对照组的细胞体外的生长情况,结果提示在SW480、SW620、SW1116、 HT29细胞中,干扰RN181能促进肿瘤细胞的增殖与克隆(p<0.05)；在RKO细胞系中,干扰RN181与对照组的细胞增殖与克隆的差异性无统计学意义(P>0.05)。5,将各组结肠癌细胞株注射至裸鼠前肢腋部皮下,成功构建裸鼠移植瘤模型。在SW116、HT29细胞系中,发现注射稳定干扰RN181细胞的裸鼠,与对照组裸鼠组相比,瘤体生长速度增快；而在RKO细胞系中,与其对照组相比,瘤体生长速度减慢。6,采用Wetem Blot的方法检测RN181干扰后重组系的的ERK、P-ERK/AKT、P-AKT表达水平。结果显示：在HT29与早期SW480结肠癌细胞系中,低表达能促进ERK/AKT的磷酸化；在RKO及晚期SW480细胞系中,低表达能抑制ERK/AKT的磷酸化。结论：在93例临床结肠腺癌组织中,RN181高表达于癌组织却低表达于相应癌旁组织,且其表达量与结肠腺癌的临床病理分期、生存时间呈负相关,与性别,病理分级,肿瘤大小的差异无统计学差异。RN181在癌旁组织中的表达无性别、年龄、病理分级、临床分期和病理分级的差异,提示RN181可能是一个新的结肠癌促进因子。荧光定量RT-PCR与Westemblot实验鉴定RN181在野生型肠癌细胞中本底表达量。通过病毒干扰技术,成功构建稳定干扰的SW480、SW620、SW1116、HT29、RKO重组结肠腺癌细胞系与其对照组系。通过CCK-8实验与平板克隆形成实验证实低表达RN181能促进SW480、SW620、SW1116、HT29细胞体外的生长,但是低表达RKO细胞系与其对照组间的体外增殖能力的差异无统计学差异。裸鼠皮下成瘤实验显示低表达RN181促进SW1116、HT29细胞的成瘤效果,而低表达的RN181细胞的RKO细胞系能抑制肿瘤的生长。在HT29与早期SW480细胞中,低表达RN181的细胞系能促进ERK与AKT的磷酸化；在RKO与晚期SW480细胞系中,低表达的RKO细胞系能抑制ERK与AKT的磷酸化。提示RN181调节大肠癌细胞的发生、发展可能通过调节ERK/AKT的磷酸化来实现的。但是低表达的RN181细胞在早期与晚期结果的不一致性,考虑与体内的微环境、蛋白的修饰作用、同源二聚体等有关。本实验结果与本课题组前期实验的结果的不一致性,考虑与不同的肿瘤细胞系相关,因此,提示RN181是一个非常复杂的双向调节蛋白,当某些微环境发生变化时,它的调节功能完全相反。关于RN181调节肠癌细胞的发生、发展是否是通过调节泛素化过程,及具体的调节肿瘤的作用机制等诸多问题,期待进一步的研究。