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商陆抗病毒蛋白(Pokeweed antiviral protein, PAP)是从商陆属(Phytolacca)植物体内提取出来的一类碱性蛋白,属于核糖体失活蛋白I型,对植物病毒、动物病毒、人体病毒甚至真菌和细菌等均有一定的抑制作用.
芥菜(Brassica juncea Coss.)在我国不仅是重要的鲜食蔬菜,而且是腌制蔬菜的重要原料.但是,芥菜易受多种病害的危害而使产量降低、品质下降,由于天然的芥菜抗源材料极少,利用常规的育种方法也很难得到抗病的优良品种.
本试验以茎瘤芥(Brassica juncea vat.tumida Tsen et Lee)蔺市草腰子的子叶为外植体,利用农杆菌介导法将来自中国商陆(Phytolacca acinosa)的N、C端缺失无毒型基因PacPAP1导入芥菜中.建立了芥菜高效稳定的植株再生体系和遗传转化体系,有6株阳性转基因植株成功收到种子;建立了检测和筛选转基因芥菜自交一代的体系,并对转基因自交一代进行了遗传学分析和表达分析;并对转基因芥菜接种病毒、真菌和细菌等多种病害,以检测是否具有抗多种病害的能力.主要结果如下:
1.在分化培养基MS+6-BA 2.0 mg/L上,最佳的外植体类型是4-6 d苗龄带子叶柄基部的子叶,其不定芽分化率为90.6％;不定芽在生根培养基MS+NAA 0.2 mg/L上的生根率为83.3％;用泥炭土移栽再生苗,成活率达75％.
2.分别采用HgCl2和NaClO对种子进行消毒,在农杆菌侵染后,经过HgCl2消毒得到的外植体绝大多数成活,而经NaClO消毒得到的外植体成活的很少.这可能由于少量重金属Hg2+的残留激活了植物体内的保护机制,使经过HgCl2消毒得到的外植体在农杆菌侵染之前已具备一定的抗逆能力.由此得到启示,人为创造适度的逆境条件,使得到的无菌苗具备一定的抗逆能力,从这种无菌苗上取下的外植体在农杆菌侵染后的成活率大大提高.
3.遗传转化最适宜的条件:经过HgCl2消毒得到的外植体预培养3d,用OD600=0.5的农杆菌浓度侵染20-25 min,共培养4d,转接至抑菌培养基MS+6-BA.2.0mg/L+Carb 500 mg/L上延迟筛选5-6 d,再转接到筛选培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+Carb 500 mg/L+Kan 30 mg/L上进行培养.将获得的已伸长的抗性芽转接到生根培养基MS+NAA 0.2 mg/L+Cef200 mg/L+Kan 15 mg/L上进行生根.
4.对抗性植株进行PCR检测、Southern杂交检测和Northern杂交检测,证实外源基因已整合到芥菜基因组上并正常表达,最终有6株转基因植株成功收到种子.人工接种芜菁花叶病毒TuMV结果显示,与非转基因植株相比,绝大多数转基因植株对TuMV具有明显抗性.
5.利用200 mg/L Kan涂抹叶片来对田间转基因自交一代T1植株进行遗传学分析。具有单拷贝的T1代株系T1-1、T1-2、T1-3和T1-5对Kan的抗性分离均符合3:l的1孟德尔分离规律;T1-7和T1-9为具有双拷贝的T1代株系,其中T1-7对Kan的抗性分离符合3:1的分离规律而不符合15:1的分离规律,由于T1-9的株数太少,未能确定该株系的抗性分离规律.
6.对转基因自交一代T1植株进行Northern杂交分析:T1代阳性单株中外源基因均能正常表达但单株之间表达量有所不同;外源使用Kan会促进外源基因在转基因阳性植株体内的表达;外源基因在转基因阳性植株的幼苗期、瘤茎膨大期和生殖生长期都可以表达,单株不同时期内表达量有所不同,同时不同单株间同一时期内表达也有所不同;在T1代阳性单株的根、茎和叶中外源基因均有表达,单株内三个部位外源基因的表达差异不大;接种病毒后植株体内外源基因的表达均有明显提高:SA和ABA对转基因阳性植株的处理对外源基因表达量的影响不大.
7.从广州市郊采集的具典型病毒病症状的菜心植株上分离到1个TuMV的分离物,命名为TuMV-GZ.运用RT-PCR方法克隆出了TuMV-GZ的外壳蛋白基因并进行了序列测定,该基因911bp编码293个氨基酸,与已发表的TuMV分离物核苷酸序列的同源性在95％-100％之间.
8.对转基因自交一代T1各株系接种TuMV、CMV和TMV后,T1代各株系阳性植株群体的病情指数均在30-40之间,群体表现为中抗,由于PacPAP1的存在,大大提高了芥菜抗TuMV、CMV和TMV多种病毒病的能力.除株系T1-9外,其他5个株系对病毒病的抗性分离规律均符合孟德尔分离规律,同Kan抗性分离结果一致.但是,T1代阳性植株对真菌类病害和细菌类病害的抗性不明显.
9.将表达PacPAp1的转基因植株总蛋白提取液与TuMV混合后接种的烟草比用非转基因植株总蛋白提取液与TuMV混合后接种的烟草上的枯斑数少,证明转PacPAP1的转基因芥菜中所产生的PAP在体外具有抗病毒的活性.