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目的全氟辛烷磺酸(PFOS)是磺酰基全氟化合物的降解产物,广泛应用于工业及民用领域。该类产品的大量使用使得其以各种途径进入到野生动物和人体内。毒理学实验证实PFOS对实验动物具有免疫毒性、生殖毒性、发育毒性、神经毒性和潜在致癌性。但目前对于发育过程中的神经毒性机制所知还甚少。本研究利用出生前、后PFOS暴露的染毒方式,通过监测母体和子代一般毒性,并检测子代大脑皮质的兴奋性递质Glu含量、信号转导重要因子PKC活性和递质受体NMDAR1基因表达,来观察出生前后PFOS暴露对不同发育期仔鼠神经发育的影响,探讨PFOS致发育神经毒性的可能机制,为PFOS安全性评价提供科学依据。材料与方法一、PFOS饲料配制以浓度2%的Tween-80为溶剂,溶解白色粉末状PFOS钾盐配制成PFOS溶液。将2%的Tween-80溶液或PFOS溶液按设计剂量充分混匀于粉状饲料中,制成PFOS浓度为0、1.6和3.2mg/kg的三种粉状饲料。二、动物分组和染毒将妊娠第一天的母鼠随机分为对照、低剂量和高剂量组,分别给予PFOS浓度为0、1.6和3.2mg/kg的三种粉状饲料,自由进食水。在仔鼠出生第一天(PND1),将对照组母鼠所产的一定数量仔鼠与暴露组母鼠所产的一定数量仔鼠做交换抚养,全部仔鼠分成:出生前后均不暴露组(CC)或持续暴露于低剂量组(LL)和高剂量组(HH)、出生前不暴露而出生后开始暴露于低剂量组(CL)和高剂量组(CH)、出生后无暴露只出生前暴露于低剂量组(LC)和高剂量组(HC)的三个类别组。染毒期至仔鼠PND35结束。三、动物处理方式分别于仔鼠PND1、7、14、21、28、35天取出所需数量仔鼠,断头处死,冰上快速取脑,PND1-14天仔鼠自断头处取血,PND21-35天仔鼠采取心脏取血,常规分离血清。至仔鼠PND35,将母鼠用乙醚麻醉,心脏取血、处死,常规分离血清。所有采集样品均保存于-70℃冰箱备用。四、观察指标与检测方法1、母鼠摄食量监测、计算食物利用率2、母鼠和仔鼠体重监测3、母鼠窝产仔数和出生当日存活率统计4、母鼠和仔鼠血清PFOS含量检测—HPLC/MS法5、谷氨酸含量检测—分光光度计法6、PKC活性检测—非放射性蛋白激酶检测法7、NMDAR1mRNA表达检测—RT-PCR法五、数据处理全部数据分析均采用SPSS 13.0统计软件。连续型变量数据以(?)表示,符合正态性分布的采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),总体比较有差异时,若方差齐选择LSD法、方差不齐选择Dunnett’s C法进行组间两两比较;不符合正态分布的采用秩和检验。组间仔鼠出生当日存活率的比较采用x~2检验。所有实验结果均来自3个平行样品以上,以p＜0.05表示差异具有统计学意义。结果一、妊娠期和哺乳期PFOS暴露对母鼠体重的影响PFOS1.6mg/kg饲料暴露组母体体重增长快于对照组,而PFOS3.2mg/kg饲料暴露组则慢于对照组,摄食量和食物利用率未见显著差异。二、出生前PFOS暴露对仔鼠出生当日存活率的影响PFOS 3.2mg/kg饲料组仔鼠出生24小时内存活率为94.1%,明显低于对照组(p＜0.05,x~2=6.65)和PFOS 1.6mg/kg饲料组(P＜0.01,x~2=11.64)。三、出生前后PFOS暴露对不同发育期仔鼠体重发育的影响PND1,CC组仔鼠体重(6.52±0.15g)明显高于LL组(5.96±0.15g)(p＜0.05,F=0.568)。发育早中期(PND1-21)暴露组体重增长较快,发育后期则落后于对照组。至PND35,CC体重(111.66±4.91g)明显高于LL组(90.18±5.91g,p＜0.05,F=21.49)和HH组(81.85±4.54g,p＜0.01,F=29.81),且此时CC、LL和HH组体重与暴露剂量具有明显剂量效应关系(r=0.92,p＜0.01)。四、母鼠、不同发育期仔鼠血清PFOS含量暴露结束时,1.6mg/kg和3.2mg/kg饲料组母鼠血清PFOS含量明显高于对照组(p＜0.05,F=45.20)。PND1,HH组仔鼠血清PFOS含量明显高于对照组(p＜0.01,F=179.09)。出生后开始暴露的CL、CH组在各发育期均明显高于对照组(p＜0.01)。只出生前存在暴露的LC、HC组在各发育期与对照组比较无明显差异。五、出生前后PFOS暴露对不同发育期仔鼠大脑皮质Glu含量的影响PND7,出生前存在暴露的LC、HC和HH组Glu含量明显高于对照组(P＜0.05,F=4.578);PND14,LC组显著高于对照组(p＜0.05,F=1.883);PND21,LL组高于、而HC组低于对照组,差异有统计学意义(p＜0.05,F=4.141)。PND28,出生后存在暴露的CL、CH组(p＜0.05,F=2.908)和LL组(p＜0.01,F=2.908)明显低于对照组。六、出生前后PFOS暴露对不同发育期仔鼠大脑皮质PKC活性的影响在PND1,HH组仔鼠大脑皮质区PKC活性明显高于对照组(p＜0.01,F=11.734);PND7,CH、HH组PKC活性明显高于对照组(CH组p＜0.05,HH组p＜0.01,F=2.761);PND21,LL组PKC活性明显高于对照组(p＜0.05,F=3.339);PND35,CH组明显低于对照组(p＜0.05,F=1.870)。七、出生前后PFOS暴露对不同发育期仔鼠大脑皮质NMDAR1mRNA表达的影响PND7,CH组皮质区NMDAR1mRNA表达明显低于对照组(p＜0.05,F=4.240);PND14,LL、HC和HH组明显低于对照组(HC组p＜0.05,LL、HH组p＜0.01,F=14.047);PND21,LC和HH组明显高于对照组(p＜0.05,F=3.114);PND28,CH、HH组表达明显低于对照组(p＜0.01,F=9.692);PND35,HC组明显高于对照组(P＜0.05,F=1.940)。结论1、本实验中,PFOS暴露对实验动物体重增长的影响表现为先刺激后抑制;2、出生前PFOS暴露可导致仔鼠出生后1-7天内死亡率增高;3、出生第一天的仔鼠血清即能检测到高浓度PFOS存在,证明PFOS可以透过胎盘屏障由母体传递给子代;4、出生前PFOS暴露可导致子代出生时大脑皮质PKC活性明显增高;出生后PFOS暴露对PKC活性的影响为先刺激后抑制。Glu含量的变化与PKC变化趋势相似。表明在本实验中,从神经兴奋性递质和信号转导因子层面而言,PFOS具有毒物刺激效应特点;5、出生前PFOS暴露可致仔鼠大脑皮质区NMDAR1mRNA表达高峰延迟,且表达值波动较大;6、在本实验中,在与非职业性暴露人群血清PFOS浓度相当的情况下,实验动物即出现神经毒性。