肝纤维化是一切慢性肝病共同的病理学基础,是涉及多种细胞、细胞因子、细胞外基质(Extrac ellular matrix, ECM)及其降解酶类、细胞凋亡等多个复杂因素的病理生理过程。各种因素之间相互影响、相互交错,形成肝纤维化的动态变化网络,而肝星状细胞(Hepatic stellate cell, HSC)的激活是这个复杂网络的中心环节。ECM成分合成和降解的失衡是导致肝组织重构、发生纤维化的直接原因,异常激活的HSC是ECM的主要来源,细胞因子及多肽类生长因子等调控因子是启动、调节HSC生物学行为的重要因素,细胞凋亡是机体自身平衡HSC数量和功能的主要手段。肝星状细胞(HSC)是肝脏中的一种非实质细胞,位于Disse间隙内,形态不规则,胞体呈卵圆形,胞质富含维生素A脂滴,核周部分包埋在邻近肝细胞的隐窝内,其对肝脏的ECM产生、生长因子合成、基质重建以及窦孔改变等生理过程均可产生影响。研究发现,多种细胞、细胞因子、ECM和非肽类介质(如乙醇、活性氧等)参与HSC的激活和肝纤维化。以往的中医药学记录了很多的单味中药和中药复方,能够间接或直接地保护肝脏,治疗肝纤维化。作为治疗肝纤维化的筛选药物,自拟方舒肝驱毒方是一个很好的选择,其中有许多原因：舒肝驱毒方中柴胡、山甲珠、丹参、赤芍、三七粉舒肝解郁,益气养阴,调理气血,凉血化瘀；白芍养肝柔肝；绞股蓝、红景天、虎杖、茵陈、茯苓等清热解毒、化湿祛浊。故舒肝驱毒方的开发和应用空间有待进一步挖掘。研究目的研究舒肝驱毒方对HSC的活化增殖及相关细胞因子网络的作用,以期揭示舒肝驱毒方抗纤维化的分子机制。研究方法1 舒肝驱毒方对HSC增殖及分泌ECM的影响1.1 绘制HSC-T6的自然生长曲线将液氮中冻存的HSC-T6细胞株进行复苏,在恒温箱中,培养到细胞呈单层致密状时,用胰蛋白酶消化之后,进行传代,在细胞生长稳定后,用MTT的方法,绘制HSC-T6的生长曲线。1.2舒肝驱毒方对HSC-T6增殖的影响细胞培养方法同前面,分别加入舒肝驱毒方高剂量、中剂量、低剂量组,用MTT法,检测细胞生长情况。1.3舒肝驱毒方对ECM合成的影响采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA,酶联免疫法(ELISA)和放射免疫法(RIA)分别检测Ⅰ型胶原和透明质酸含量。2舒肝驱毒方对相关细胞因子网络的调节作用2.1 舒肝驱毒方对转化生长因子(TGF)-β1的抑制作用舒肝驱毒方对HSC-T6细胞TGF-β1mRNA的影响用RT-PCR检测,对HSC-T6细胞TGF-β1蛋白的影响用Western Blot法检测,对TGF-β1受体的影响采用流式细胞技术检测。舒肝驱毒方对TGF-β1的下游效应递质结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的影响用RT-PCR检测。对AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1mRNA的抑制作用用RT-PCR检测,对AngⅡ刺激HSC活化碱性成纤维生长因子(bFGF)表达的抑制作用用免疫组化法检测。用RT-PCR检测舒肝驱毒方对IFN抑制HSC活化TGF-β1mRNA的促进作用。2.2舒肝驱毒方对血小板源性生长因子(PDGF)的抑制作用舒肝驱毒方对HSC-T6细胞PDGFmRNA的影响用RT-PCR检测,对HSC-T6细胞PDGF蛋白的影响用Western Blot法检测,对PDGF受体的影响采用流式细胞技术检测。舒肝驱毒方对胰岛素样生长因子(IGF) mRNA的影响用RT-PCR检测。2.3舒肝驱毒方对血管紧张素(Ang)ⅡI刺激HSC活化Ca2+效应的抑制作用舒肝驱毒方对AngⅡ刺激HSC活化Ca2+效应的抑制作用采用激光扫瞄共焦显微镜(LSCM)检测。研究结果1 舒肝驱毒方对HSC增殖及分泌ECM的影响1.1舒肝驱毒方对HSC-T6增殖的影响实验结果显示：在舒肝驱毒方作用第5天日后舒肝驱毒方组三个剂量组中的细胞生长曲线都没有受到抑制,出现一定的刺激促进生长增殖的效果,其OD值与对照组比较,差异均具有显著性意义(P<0.05)。实验提示舒肝驱毒方高、中、低剂量组对HSC-T6的增殖没有明显的抑制作用。1.2舒肝驱毒方对ECM合成的影响各舒肝驱毒方组对Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA都有明显的抑制作用,同对照组相比较,具有显著性意义(P<0.05)。实验结果表明：舒肝驱毒方对HSC-T6细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达抑制作用非常明显。在药物作用72h时,对照组与舒肝驱毒方高、中、低剂量组Ⅰ型胶原分泌比较,差异均有显著性意义(P<0.05),实验结果显示舒肝驱毒方作用72h后对Ⅰ型胶原分泌有出现明显抑制作用,这一作用显现出一定的剂量依赖。提示舒肝驱毒方高、中剂量组均有抑制透明质酸分泌的趋势(P>0.05),但没有显著性意义。2舒肝驱毒方对相关细胞因子网络的调节作用2.1舒肝驱毒方对TGF-β1的抑制作用2.1.1 舒肝驱毒方对乙醛作用下HSC-T6细胞TGF-β、CTGFmRNA和TGF-β及其受体的抑制作用乙醛组对TGF-β mRNA有一定促进作用,但与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。乙醛组对CTGFmRNA也有明显促进作用,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。各舒肝驱毒方组对TGF-βmRNA、CTGFmRNA抑制作用都非常明显,与乙醛组比较,差异均有显著性意义(P<0.05)；各舒肝驱毒方组组间比较,TGF-β mRNA差异均有显著性意义(P<0.05),CTGFmRNA舒肝驱毒方高、中剂量组与低剂量组比较,差异均有显著性意义(P<0.05),但舒肝驱毒方高、中剂量组组间比较,差异无显著性意义(P>0.05)。提示舒肝驱毒方对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β、 CTGF mRNA均有明显的抑制作用,且与剂量成正比。乙醛组对TGF-β蛋白表达有明显促进作用,各舒肝驱毒方组对TGF-β蛋白表达,无论在24h还是72h,则均有非常明显的抑制作用。24h时以舒肝驱毒方高剂量组最为明显,舒肝驱毒方中剂量组次之,舒肝驱毒方低剂量组再次之；72h时以舒肝驱毒方高剂量组最为明显,舒肝驱毒方低剂量组次之,舒肝驱毒方中剂量组再次之。提示舒肝驱毒方对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β蛋白表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用有可能与剂量成正比。对照组TGF-β1受体表达非常微弱,乙醛组对TGF-β1受体表达有明显促进作用；各舒肝驱毒方组对TGF-β1受体表达均有明显的抑制作用,但舒肝驱毒方高、中、低剂量组间不存在递进关系。提示乙醛可显著刺激HSC细胞TGF-β1受体表达,舒肝驱毒方对乙醛作用下的HSC-T6细胞TGF-β1受体表达有明显的抑制作用,但这种抑制作用可能并不与剂量成正比。2.1.2舒肝驱毒方对AngⅡ刺激HSC活化TGF-β1mRNA、bFGF的抑制作用AngⅡ组对TGF-βmRNA有一定促进作用,但与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。各舒肝驱毒方组对TGF-βmRNA则均有明显的抑制作用,与AngⅡ组比较,高、中剂量组差异均有显著性意义(P<0.05),而低剂量组仅有抑制趋势,差异并无显著性意义(P>0.05)。提示AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6细胞TGF-βmRNA作用,但不甚明显；而舒肝驱毒方对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞TGF-βmRNA抑制作用较为明显,并且这种抑制作用与药物剂量成正比。AngⅡ组、对照组、各舒肝驱毒方组均未见bFGF的阳性表达。2.1.3舒肝驱毒方对干扰紊IFN抑制HSC活化的促进作用IFN组对TGF-βmRNA有明显的抑制作用,与对照组比较,差异有显著性意义(P>0.05)；而舒肝驱毒方各剂量组与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。舒肝驱毒方高、中剂量组与IFN组比较,差异有显著性意义(P<0.05)；而舒肝驱毒方低剂量组与IFN组比较,差异则无显著性意义(P>0.05)。提示IFN确实有强烈的抑制TGF-βmRNA效果；但舒肝驱毒方对这一效果不但没有协同促进作用,反而对这一效果可能有一定的抑制作用。2.2舒肝驱毒方对PDGF的抑制作用舒肝驱毒方高剂量组对PDGFmRNA、IGFmRNA有较明显的抑制作用,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05),与舒肝驱毒方高、中剂量组比较,差异也有显著性意义(P<0.05)。但舒肝驱毒方高、中剂量组未表现出抑制作用(P>0.05)。提示舒肝驱毒方在低剂量对HSC-T6细胞PDGFmRNA和IGFmRNA有明显的抑制作用。各舒肝驱毒方组对PDGF蛋白表达,无论在24h、48h还是72h,均有非常明显的抑制作用,各时间点均以舒肝驱毒方高剂量组效果最好。对照组、各舒肝驱毒方组PDGFR-α和PDGFR-β的表达都极微弱,且均相差无几。2.3舒肝驱毒方对AngⅡ刺激HSC活化Ca2+的抑制作用LSCM下Ca2+荧光成像的HSC-T6细胞仍可部分表现普通倒置显微镜下的形态学特征,AngⅡ组Ca2+荧光强度非常明显,清晰可见；对照组强度也较明显,稍次于AngⅡ组；舒肝驱毒方高剂量组强度也较强,稍次于AngⅡ组和对照组,但区别不甚明显；舒肝驱毒方中、低剂量组强度明显减弱,并可见大量Ca2+噬斑出现。Ca2+荧光强度相对值的统计分析也反应上述结果。结论1 舒肝驱毒方对HSC增殖及分泌细胞外基质(ECM)的影响舒肝驱毒方对HSC-T6细胞I型、ⅠⅢ型胶原mRNA表达抑制作用较为明显；HSC-T6分泌Ⅰ型胶原作用的研究也印证了上述结果；而对于这一抑制作用的产生,舒肝驱毒方可能存在最好的剂量[舒肝驱毒方中剂量(10-4mol/L)组]。舒肝驱毒方对透明质酸分泌的抑制作用可能存在,但不显著。2舒肝驱毒方对相关细胞因子网络的调节作用加入乙醛刺激后的HSC-T6细胞TGF-β mRNA、CTGFmRNA有所增加,表明乙醛可刺激HSC增殖,导致纤维结缔组织增生和降解失去平衡,肝脏ECM异常沉积,是酒精性肝纤维化发生的关键因素。舒肝驱毒方对TGF-β mRNA、CTGFmRNA均有非常明显的抑制作用,并且呈现剂量依赖模式；且TGF-β、CTGF具有相关系的变化趋势。舒肝驱毒方对TGF-β蛋白及其受体表达均有明显的抑制作用,其中在蛋白表达的抑制作用方面,与对TGF-βmRNA影响一致的呈现一定的剂量依赖模式。在TGF-β受体的抑制作用方面,效果也较为显著,但不存在剂量依赖模式。舒肝驱毒方对HSC-T6细胞TGF-β、CTGF细胞因子的序贯抑制作用,是其参与抗肝纤维化细胞因子网络的重要切入点。AngⅡ可能存在一定的刺激HSC-T6细胞TGF-PmRNA表达作用,但不甚明显,未及前面实验中的乙醛刺激。同样,AngⅡ也不能有效刺激bFGF蛋白的表达,也进一步说明了这一结果。而舒肝驱毒方对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞TGF-β mRNA表达有明显的抑制作用,且这种抑制作用与剂量成正比,再次证明了前文的研究结果。在肝纤维化发生发展的过程中,常伴有肾肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的异常激活,对病情发展起着重要的促进作用,故AngⅡ也是肝纤维化细胞因子网络的重要调控因子。而本研究证明,舒肝驱毒方也可通过这一环节来起到抗肝纤维化的作用。IFN-γ对TGF-β mRNA有明显的抑制作用,但舒肝驱毒方对IFN-γ的这一抑制效果不但没有协同促进作用,反而可能有一定的抑制作用。舒肝驱毒方对PDGF、IGFmRNA均有明显的抑制作用,这种抑制作用可能与剂量有相关性,且PDGF、IGF具有相关系的变化趋势。舒肝驱毒方组对PDGF蛋白表达的明显抑制作用也呈现出一定的剂量依赖的模式,与RT-PCR研究结果一致。舒肝驱毒方也可通过影响PDGF及IGF来参与抗肝纤维化细胞因子网络的调控。AngⅡ还可能存在一定的刺激HSC-T6细胞活化Ca2+的效应,但不甚明显。这可能与AngⅡ刺激作用有限有关,也可能是由于其他因素导致HSC生物转化功能下降的原因。舒肝驱毒方对AngⅡ作用下的HSC-T6细胞活化Ca2+效应有明显的抑制作用,可能是由于舒肝驱毒方可以阻断或抑制HSC的AngⅡ信号转导通路,从而抑制了HSC内Ca2+升高的作用,并因此抑制了HSC的活化与增殖。