【摘 要】
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首先从发酵液中获得4个水蛭素活性组分(Hir65,Hir64,Hir63和Hir62)的纯品.然后将4个组分分别加入不同发酵时间的发酵上清及细胞裂解上清内进行裂解,以探讨发酵过程中水蛭素的
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首先从发酵液中获得4个水蛭素活性组分(Hir65,Hir64,Hir63和Hir62)的纯品.然后将4个组分分别加入不同发酵时间的发酵上清及细胞裂解上清内进行裂解,以探讨发酵过程中水蛭素的降解机制.最后通过控制发酵液中铵浓度,大大减少了Hir65的降解.水蛭素分离纯化的关键步骤是反相层析.通过优化一系列纯化条件,柱体积由13 ml放大到160 ml,样量处理量则由16 ml提高到175 ml,同时获得较为理想的分离效果,满足了水蛭素降解研究对纯化样品的需要.在研究中发现,Hir65在细胞裂解上清中的降解程度比在发酵上清中强,其在60-81 h的罐培养中的降解动力学与在60 h的发酵上清中相似而与在同期细胞裂解上清中显著不同.由此推断水蛭素的降解发生于胞外.通过将Hir65,Hir64和Hir63分别加入无水蛭素活性的细胞裂解上清中进行降解,发现Hir64,Hir63和Hir62为Hir65的C末端次递切除一个氨基酸的产物.从此推测降解水蛭素的酶可能为羧肽酶.羧肽酶的释放与发酵过程中细胞死亡及细胞的生理状态密切相关.为了减少水蛭素的降解,采用新的发酵策略:以0.025 mol/L初始铵离子开始发酵,当细胞进入生长阶段,将铵离子浓度提高到0.6 mol/L,结果在提高了水蛭素产量的同时,抑制了水蛭素降解.Hir65及总水蛭素的表达量分别达2.63 g/L和4.25 g/L.
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