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目的:①探讨原位PBS灌注、胶原酶离体消化、梯度离心、选择性贴壁四步法分离Kupffer细胞(KCs)的效果。②证实NLRP3炎症小体在游离脂肪酸(FFA)激活KCs炎症反应中的作用。③阐述NLRP3在LPS激活KCs炎症反应中的可能作用。④初步明确FFA促进LPS激活KCs炎症反应,探讨FFA通过激活NLRP3调节IL-1表达的途径增加LPS激活KCs炎症反应作用的可能机制。方法:①采用原位PBS灌注+胶原酶离体消化+梯度离心+选择性贴壁四步法分离KCs,根据具体步骤方法不同随机分为3组:无胶原酶原位灌注+PBS梯度离心组(改良A组)、无胶原酶原位灌注+Percoll细胞分离液密度梯度离心方法组(B组)、胶原酶原位灌注+Percoll细胞分离液密度梯度离心方法组(C组)。动态观察KCs的生存时间及形态变化,应用F4/80(BM8)标记KCs特异抗原,进行免疫细胞化学染色及免疫荧光检测鉴定KCs及判断纯度;吞墨试验了解KCs的吞噬功能,应用台盼蓝拒染试验判断细胞的活性,比较不同组别分离方法的KCs得率、活性及纯度。②首先分离小鼠KCs观察不同浓度的FFA对KCs炎症反应影响; KCs随机分为5组:Control组,加培养基、0.2mmol/L组、0.3mmol/L组、0.4mmol/L组、0.5mmol/L组;FFA刺激24h后, Western blot检测NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白表达,实时荧光定量PCR(real time qPCR)检测NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA表达, ELISA检测KCs培养上清液IL-1、IL-18的表达情况。其次了解在固定FFA浓度(0.35mmol/L)对KCs的炎症反应的时间-效应关系,KCs随机分5组,对照组加入培养基及相应量的BSA、4h组、8h组、12h组、24h组,分别给予0.35mmol/L的FFA刺激,检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及基因表达以及IL-1、IL-18的变化情况。最后KCs随机分为4组:Control组加培养基及相应量的BSA、FFA组、FFA+NLRP3siRNA组、FFA+Control shRNA组;shRNA转染KCs后8h通过荧光显微镜鉴定转染效果。FFA刺激24h后,检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达和IL-1、IL-18的变化情况,分析NLRP3在FFA致KCs炎症反应中的作用。③首先探讨LPS致KCs炎症反应的量效关系,分离的KCs随机分为4组:Control组、LPS组(0.5ug/ml)、LPS(1ug/ml)组、LPS(2ug/ml)组,LPS刺激24h后,检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达及IL-1、IL-18的表达情况。其次分离小鼠KCs随机分为4组:Control组、LPS组(1ug/ml)、LPS(1ug/ml)+shRNA组、LPS(1ug/ml)+Control siRNA组,LPS刺激24h,检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达以及IL-1、IL-18的变化情况,分析NLRP3在LPS激活KCs炎症反应中的作用。(4)分离小鼠KCs随机分为6组:Control组、FFA组、LPS组、FFA+LPS组、FFA+LPS+shRNA组、FFA+LPS+Control shRNA组;检测KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC的蛋白及其基因表达以及IL-1、IL-18的表达情况,分析FFA对LPS激活KCs炎症反应的影响。结果:①刚分离的KCs细胞近似类圆形,接种1h后,此时收获细胞纯度较高,但由于贴壁时间短,部分KCs未贴壁使细胞得率相对较低,KCs贴壁培养2h后细胞的得率及纯度相对较高。观察KCs形态见在荧光显微镜下328nm荧光未能激发KCs发出荧光,培养2天后,细胞充分伸展,表现形状多样性,可呈现星形或不规则形,培养KCs最长见存活4周。F4/80免疫细胞化学染色及免疫荧光行激光共聚焦显示分离的细胞为KCs;吞墨试验表现为KCs吞噬大量碳素颗粒,台盼蓝染色表现为正常KCs拒染,凋亡细胞表现为被染成蓝色,计数各组KCs的活性数目均在90%左右。综合得率、纯度及活性判断改良法原位PBS灌注+胶原酶离体消化+梯度离心+选择性贴壁四步法分离KCs与其它两组无明显差异(P>0.05),是一种简便有效分离KCs的方法。②NLRP3shRNA质粒能够高效转染KCs,荧光显微镜下观察转染后8小时KCs转染效果可以达到85%。FFA刺激KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC表达明显升高,培养液的IL-1、IL-18表达水平明显升高(P<0.001),同条件干预组内NLRP3、Caspase-1、ASC的表达趋势无明显差异(P>0.05)。NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC及IL-1、IL-18的表达(P<0.001)。③LPS刺激后,KCs的IL-1、IL-18表达水平明显升高,但是NLRP3、Caspase-1、ASC的表达改变不明显(P>0.05),NLRP3基因沉默,无明显抑制LPS激活KCs的IL-1、IL-18升高(P>0.05)。④FFA明显增加了KCs对LPS的敏感性,促进LPS致的致KCs炎症反应,KCs的NLRP3、Caspase-1、ASC以及IL-1、IL-18表达明显升高,致炎作用明显高于单独FFA或者LPS的作用(P<0.001),NLRP3基因沉默可以有效地抑制NLRP3、Caspase-1、ASC的表达,细胞培养液中IL-1、IL-18的含量水平明显降低(P<0.001)。结论:①原位PBS灌注+离体胶原酶消化+梯度离心+选择性贴壁四步法分离法简化了KCs的提取分离,是一种有效、简便、经济的分离KCs的方法。②高浓度的FFA对KCs存在明显脂毒性,NLRP3炎症小体介导了FFA诱导的KCs的炎症反应,FFA通过激活KCs的NLRP3、ASC、Caspase-1表达促进分泌IL-1、IL-18炎症因子,而激发KCs在NASH中的炎症反应,阻断NLRP3信号通路可能是拮抗FFA促进NASH的新途径。③LPS能够明显激活KCs产生炎症反应分泌IL-1、IL-18,但是LPS致KCs炎症反应并不依赖于NLRP3通路。④FFA能够明显促进LPS激活KCs炎症反应,当shRNA抑制NLRP3后FFA促进LPS致KCs的炎症反应作用明显减弱,提示FFA可能依赖于NLRP3激活IL-1的途径促进LPS致KCs炎症反应,从而放大FFA脂毒性基础上的LPS激活KCs炎症反应作用,参与NASH的炎症反应。