慢性病毒性肝病严重的病理转归为肝硬化，在临床治疗慢性乙型病毒性肝炎中如何阻止甚至逆转肝硬化是治疗病毒性肝炎的难点也是热点。肝纤维化则是其前期病变，能否阻止抑或逆转肝纤维化是治疗各种慢性肝病的关键。 随着临床抗乙型病毒性肝炎的治疗进展，认为IFNα不仅有抗病毒作用，IFNα也有抗肝纤维化作用。本实验通过检测慢性乙型病毒性肝炎患者肝组织炎症和纤维化程度，检测TGFβ1、Fas抗原，细胞凋亡，肝纤维胶原定量，HBsAg及血清肝纤维化胶原HA、LN、Ⅲ、Ⅳ含量，观察Fas抗原、TGFβ1与细胞凋亡及胶原分布的关系；细胞凋亡与肝纤维化的关系；HBcAg分布与肝细胞凋亡的关系；肝纤维化程度与血清纤维四项的关系。进一步研究干扰素α治疗前后肝组织Fas抗原及TGFβ1表达的分布、肝组织炎症及纤维化与血清胶原定量的改变。从病理组织学角度观察干扰素α临床抗慢性病毒性肝炎肝纤维化的作用。 方法： 动物实验部分 1.1动物来源：Wistar大鼠，由河北医科大学动物实验室提供健康清洁级大鼠，重180-220g，雄性，32只。 1.2动物喂养：饲以玉米面为主杆状饲料，自由饮水，实验前自由喂养1周，后随机分为5组。皮下注射CCL4。第1次用0.5ml/100g体重，以后每隔3天皮下注射40％花生油剂CCL40.3ml/100g体重。注射CCL4确保在皮下，防止溃疡发生；注射CCL4要称体重，按体重增减调整剂量。 1.3动物分组.：A组(正常对照组)：2只。正常进食、水，实验第一天皮下注射400ml/L的花生油滴液5ml/kg，以后每隔3天皮下注射3ml/kg，同时肌肉注射生理盐水0.01ml/kg，每隔3天，共6周。B组(模型对照组)：8只。正常进食、水。实验第一天皮下注射400ml/L的CCL4花生油滴液5ml/kg，以后每隔3天皮下注射3ml/kg，同时肌肉注射生理盐水0.01ml/kg，每隔3天，共6周。C组(IFN预防组)：8只。造模方法同B组，同时肌肉注射IFNα，1×106U/100g，每隔3天，共6周。D组(IFN治疗组)：8只。造模方法同B组，CCl4染毒时间12周，造模后第6周，肌肉注射IFNα，1×106U/100g，每隔3天，6周，共12周。E组：(生理盐水对照组)6只。造模方法同D组，造模第6周肌肉注射生理盐水0.01ml/kg，每隔3天，共12周。 1.4动物处理：3周末断颈处死B、C组大鼠各1只，6周末分别断颈处死A组2只、B组大鼠7只、C组大鼠7只，12周末处死D组大鼠7只、E组大鼠5只。处死前称体重，分离血清，-20。C冰箱保存。剖腹取1cm×1cm×0.5cm肝右叶1块用10％中性甲醛固定，常温下保存，(勿放入冰箱内)。 1.5同期检测ALT，同位素检测大鼠血清透明质酸(HA)，Ⅳ胶原。 2肝脏病理学检查：肝组织病理经10％甲醛固定24h,修切后自来水冲洗12h,从35％乙醇开始系列乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋后切成3um厚的薄片，37℃烘箱内烘干。分别行HE染色观察肝组织病理变化，观察肝纤维化需做HE、Masson染色及VG染色。观察肝组织炎症活动度(G)及肝纤维化程度(S)。 3免疫组织化学检查：TGF-β1、Fas抗原，TIMP-1，Ⅳ型胶原。 4肝细胞凋亡原位检测 采用TUNEL法，严格按试剂盒说明书进行操作。以不加未端脱氧核酸转移酶(TdT)作为阴性对照。光镜下观察，胞核染成棕黄色的为阳性细胞。 5统计学处理：所取数据以x±s表示，两均数比较采用t检验，计数等级资料用秩和检验和Ridit分析。用SAS统计软件操作。 结果： 动物实验部分 1.1大鼠一般状况观察 实验期间对照组大鼠A组体重保持稳定，大鼠无一例死亡，实验结束时体重增加76±9克。B、C、D、E组大鼠皮毛无光，食欲下降，体重减轻，D组死亡1例，E组死亡1例，共死亡2只。干扰素组与模型组体重在造模前与模型组无差异，造模后与对照组差异显著,P＜0.05。 1.2大鼠肝脏大体形态 第3周CCl4组大鼠的肝脏明显肿大，呈暗红色。第6周肝脏肿大，表面可见密集细小结节，质地较韧。第12周大鼠表面形成为密集细小结节，质地韧，边缘钝，第12周D组1例，E组2例形成腹水。 1.3肝组织病理学HE、Masson检查 对照组A组肝小叶结构正常，第6-12周，模型组B、E组CCl4所致的大鼠肝纤维化组织中可见正常肝小叶结构丧失，肝血窦扩张充血，肝细胞颗粒变性明显，小血管扩张，肝内血管结构紊乱，大片灶状肝细胞变性、坏死及空泡变，肝细胞气球样变性明显，部分伴有脂肪变性。汇管区纤维组织增生，汇管区及中央静脉周围大量粗大纤维间隔交联，包绕形成假小叶，正常肝小叶结构已被破坏。 CCl4诱导大鼠肝纤维化，在造模的第3周，模型组大鼠肝细胞脂肪变性，炎症细胞浸润，胶原组织增生，属纤维化Ⅱ级，为肝纤维化期。第6周，模型组肝组织中纤维组织增生明显，分割包绕肝小叶，有假小叶形成趋势及假小叶形成，病理学肝纤维化分级多为Ⅲ-Ⅳ级，为肝硬化早期。第12周随造模过程的持续，炎症细胞浸润，主要以粗大纤维分割为主和假小叶生成，属肝纤维化Ⅳ期，肝硬化晚期。Masson染色示汇管区大量胶原纤维增生，分割肝组织，形成典型假小叶，说明肝纤维化造模成功。 IFNα治疗组肝小叶结构尚存，肝窦腔内瘀血明显，有血栓形成。肝细胞有碎屑坏死，嗜酸小体多见。汇管区大量炎细胞浸润。Masson染色见胶原纤维增生显著，向小叶内伸展，可见相互连接的纤维隔，肝小叶结构紊乱。第6周，IFNα治疗组肝纤维化程度均较单纯CCL4造模B组肝纤维化程度为低((P＜0.05)，第12周，肝组织模型及干扰素治疗组均为肝硬化病理改变(P＞0.05)。 第3周，肝纤维化大鼠血清Ⅳ型胶原及HA明显升高。第6周，模型组和干扰素干预组大鼠血清Ⅳ胶原水平与对照组相比均显著升高(P＜0.05)，与模型组组比，干扰素预防组Ⅳ含量明显降低(P＜0.05)。第12周，大鼠干扰素治疗组血清Ⅳ较第6周血清Ⅳ水平无显著差异(P＞0.05)。第12周模型组和干扰素干预组内相比，干扰素干预组血清Ⅳ胶原较模型组显著下降(P＜0.05)。 正常对照组未见肝组织细胞凋亡，第3周大鼠肝组织细胞凋亡显著，第6周肝细胞凋亡均显著，但干扰素与模型组间比较未见显著差异(P＞0.05)，第12周细胞凋亡组内未见差异，与第6周比较也未见显著差异(P＞0.05)。 1.4免疫组化检查 2.4.1TGFβ1及Fas抗原表达：免疫组化显示正常肝组织不表达或仅微弱表达TGFβ1和Fas抗原，随着肝纤维化的发生、发展,TGFβ1和Fas抗原表达逐渐增多，模型组及干扰素预防组均较对照组TGFβ1表达增强。第3周，模型组及干扰素预防组TGFβ1表达增强，第6周模型组B组较干扰素预防C组TGFβ1表达增强，且差异显著(P＜0.05)。第12周，干扰素组较模型组表达无显著差异(P＞0.05)。 第3周，Fas抗原在CC14诱导的肝纤维化的肝组织大量表达。第6周，干扰素干预组Fas抗原表达较模型组B组减轻(P＜0.05)，第12周干扰素组较模型组Fas抗原表达减轻，但无显著差异。 2.4.2大鼠肝组织细胞凋亡：正常对照组未见肝组织细胞凋亡，第3周大鼠肝组织细胞凋亡显著，第6周细胞凋亡组内未见差异，与第12周比较也未见显著差异。 2.4.3大鼠肝组织TIMPl表达：实验组正常大鼠肝组织中仅见个别弱染色的TIMPl表达细胞，散在分布于某些血管壁周围。CCl4组肝损伤期多数大鼠肝组织内均检出TIMPl，各组间阳性程度无显著差异。 2.4.4Ⅳ胶原表达：第6周-12周，汇管区，棕黄色颗粒的沉积显著增强，其阳性程度，干扰素干预的C组较模型组B组显著轻，P＜0.05,第12周模型组E组较第6周的模型B组Ⅳ胶原表达程度更加显著(P＜0.05)，第12周干扰素治疗组D组与第6周的干扰素预防组C组间表达程度无显著差异，但第12周干扰素治疗的D组Ⅳ胶原表达程度较E组显著轻(P＜0.05)。 结论： 1临床部分 ①慢性乙型病毒性肝炎患者，随着肝纤维化程度增高，Fas抗原、TGF-β1表达增强；肝细胞凋亡明显增多。②干扰素α可下调Fas、TGF-β1的表达，显著减少肝细胞凋亡。③干扰素α治疗肝纤维化需要持续的疗程，6-9个月才可见显著疗效，尤其治疗9个月的疗效更加显著，炎症细胞浸润显著减轻，呈轻度纤维化表现。 2实验部分①大鼠在CCL4诱导下，肝纤维化造模成功；模型组大鼠肝纤维化在造模周期中，有典型的肝硬化形成过程；与模型组相比干扰素预防组肝纤维化程度降低，表明干扰素能明显改善纤维化程度。②TGFβ1、Fas抗原、TIMPl、Ⅳ胶原与肝纤维化程度密切相关，其中Fas抗原的表达与肝细胞炎症程度密切相关。③干扰素α有下调TGFβ1、Fas抗原、Ⅳ胶原表达的作用，推测与减轻肝纤维化程度有关，但干扰素α对TIMPl表达无明显影响。 临床部分研究和动物实验均表明干扰素α有显著的抗肝纤维化作用，应积极在肝纤维化形成过程的早期进行干扰素α干预，因此肝硬化的预防应在肝纤维化早期进行，本研究为临床治疗肝纤维化探索了一条新的途径。