肠道病毒71型(EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)的重要成员。EV71感染主要引起手足口病(Hand-Foot-Mouse Disease),可导致严重的神经系统综合症,是手足口病重症和死亡病例的主要原因。目前临床上尚无针对EV71的有效疫苗和特异抗病毒药物。EV71病毒基因组为单股正链RNA分子,包含一个单一读码框,编码4个结构蛋白(VP1,VP2,VP3,VP4)和7个非结构蛋白(2A,2B,2C,3A,3B,3C和3D)。基因组5’和3’端为非编码区(untranslated region,UTR),5’UTR内含有内部核糖体进入位点(IRES)等复制翻译调控元件,3’UTR内含有三个茎环结构和PolyA元件。非结构蛋白3C蛋白酶(3Cpro)是病毒基因组编码的两个蛋白酶之一,主要负责除VP1-2A、 VP2-VP4位点以外,病毒多聚蛋白其它位点的切割。此外,3Cpro还可对部分宿主蛋白进行切割,是病毒-宿主相互作用过程中的关键蛋白。但目前对于3Cpro在宿主细胞内的表达与转运机制尚不清楚,迫切需要明确3Cpro在感染过程中的时空动态分布情况,为后续研究奠定基础。利用反向遗传学技术,本研究构建了EV71国内流行株基因组全长感染性cDNA克隆,并对恢复病毒进行了鉴定；双砷-四半胱氨酸成像技术是近年来新兴的蛋白荧光标记技术,可以对带有CCPGCC多肽序列(TC标签)的蛋白进行实时荧光成像,因此我们在全长感染性cDNA克隆的基础上构建了在3Cpro标记有TC标签的重组病毒,并对该病毒的生物学性质进行了鉴定；最后利用双砷-四半胱氨酸成像技术对重组病毒进行了实时成像,获得了3Cpro在宿主细胞内表达与转运的动态图像,明确了3Cpro在感染细胞内的时空分布特征。1.EV71基因组全长感染性cDNA克隆的构建与鉴定首先,基于EV71国内流行株,构建了EV71基因组全长感染性cDNA克隆。利用高保真DNA聚合酶,将病毒基因组进行全长RT-PCR扩增,同时在基因组5’端上游引入SP6启动子序列和SnaBⅠ单克隆位点,在3’端polyA下游引入MluⅠ单克隆位点。然后将全长基因组经双酶切后克隆至基于pBR322载体改造的pEV载体,酶切鉴定及核酸序列测定结果表明,构建了EV71国内流行株基因组全长克隆A12。为了鉴定基因组全长克隆是否能够拯救出具有感染性的病毒颗粒,将全长cDNA克隆线性化后进行体外转录,将转录产物利用电穿孔及脂质体法转染RD细胞,获得恢复病毒。将恢复病毒在RD细胞上进行传代,接种后12h即可观察到典型的细胞病变,与野生型病毒出现病变时间一致；间接免疫荧光鉴定结果显示,感染后6h的RD细胞中即可检测到病毒特异蛋白；蛋白印迹(WB)实验表明,恢复病毒能够表达病毒特异的衣壳蛋白。恢复病毒在RD细胞上能够形成蚀斑,蚀斑形态和出斑时间均与野生型病毒一致。一步生长曲线显示,恢复病毒的滴度在感染细胞48h后达到最高,滴度为107PFU/ml,证明恢复病毒的感染性与增殖活性与野生型病毒一致。此外,还对电穿孔和脂质体法拯救病毒的效率进行了比对,在850V电压下进行电穿孔转染,细胞在转染后48h开始观察到病变,96h后病变达到100%,但是同样量的RNA经脂质体转染后,12h即可观察到病变,48h后达到完全病变,表明脂质体法转染效率较高。以上结果表明,成功构建了EV71全长感染性cDNA克隆A12,可用于后续的基因改造工作。脂质体转染操作简便,转染效率高,首选脂质体法作为病毒拯救的手段。2.EV713Cpro蛋白实时可视化重组病毒的构建与鉴定为了利用EV71全长感染性cDNA克隆对3Cpro进行细胞内表达与转运研究,将多肽序列CCPGCC插入3Cpro181位S和182位E之间,构建实时可视化的报告病毒。将获得的重组质粒进行体外转录并转染RD细胞,转染12h后即可观察到EV71典型细胞病变,36h后病变完全；将恢复病毒在RD和Vero(?)田胞上进行传代,24h后可见EV71典型细胞病变；将恢复病毒接种细胞后,利用间接免疫荧光和免疫印迹均可检测到病毒衣壳蛋白VP1和3Cpro蛋白的表达,并且表达量随感染时间的延长而提高；恢复病毒在RD细胞上能够形成蚀斑,其蚀斑形态和出斑时间均与野生型一致；一步生长曲线结果显示,恢复病毒的增殖能力和野生型病毒基本一致。对连续传代后的病毒进行序列测定,结果表明,重组病毒基因组在传代过程中保持稳定,插入序列无突变或缺失。以上结果表明,成功获得了在3Cpro标记有TC标签的恢复病毒,该病毒的生物学性状与野生型病毒一致,其基因组序列稳定,插入的TC标签能够稳定遗传。3.EV713Cpro蛋白在感染过程中的实时动态分析为了利用恢复病毒对3Cpro进行细胞内表达与转运研究,首先用双砷显色试剂(FlAsH-EDT2)对插入的TC标签进行成像。结果证实,恢复病毒的3Cpro能够被荧光标记,其对3Cpro在细胞内的定位与传统的免疫荧光相同。进一步利用该恢复病毒对病毒感染细胞的过程进行实时成像,发现3Cpro在病毒感染后4.5h到5h时开始表达,5h到6h内完成入核过程。上述结果印证了3Cpro表达后入核的过程,并明确了从表达到入核的时间,为深入研究3Cpro的作用,阐明病毒复制过程以及病毒-宿主相互作用机制奠定了基础。最后利用该恢复病毒与宿主蛋白CstF-64进行共定位分析,验证了3Cpro入核后对该蛋白进行切割。这证实带有TC标签的恢复病毒能够进一步用于病毒-宿主相互作用的研究。本研究首先构建了基于国内流行株的EV71全长感染性cDNA克隆,在此基础上,对病毒基因组进行改造,利用双砷-四半胱氨酸成像技术构建了能够实现3Cpro实时成像的报告病毒,并利用其对病毒-宿主相互作用的关键蛋白3Cpro进行了研究。研究结果证实,3CproC端181S-182E位能够容忍外源基因的插入,可作为对该蛋白进行标记的潜在位点；报告病毒的生物学特征与野生型病毒一致,且基因组稳定；3Cpro在病毒感染早期即开始合成,合成后1h内开始聚集,并迅速完成入核过程；该报告病毒能够用于病毒-宿主相互作用的研究。上述研究结果为最终阐明3Cpro在病毒感染过程中的作用奠定了基础。