前言　　炎症性肠病（inflammatoryboweldisease，IBD）是一种复杂的多因素疾病，包括克罗恩病(Crohn'sdisease)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)，是一组原因不明的肠道慢性非特异性炎症，在美国其发病人数为1.4亿，而欧洲国家为2.2亿，在中国炎症性肠病的发病率也在逐年上升。胃肠道是一个具有免疫屏障功能的器官，每克肠组织含有大约1011个细菌，包括至少395种不同的细菌种属和食物抗原，刺激粘膜免疫系统。虽然有这些潜在的免疫原，正常的胃肠道几乎很少发生炎症，结肠上皮的屏障功能抑制肠道常驻菌介导的炎症，表达抑菌多肽，这些功能有助于维持胃肠道的稳态。IBD的发病与许多不同的因素有关，包括常驻菌群、上皮屏障功能或免疫应答失调。虽然宿主与环境因素均可导致炎症性肠病的发生，大量的临床和实验研究发现肠道稳态失衡以及针对自身肠道菌群出现异常的免疫反应是炎症性肠病发病的主要原因。目前大量的基础和临床研究认为Th1/Th2在IBD的发病中起到重要的作用，但是仍有一些问题不能得到满意的解释。　　本实验采用2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzenesulfonicacid，TNBS）灌肠诱导BALB/C小鼠建立炎症性肠病动物模型，体外培养小鼠的肠系膜淋巴结细胞和脾淋巴细胞，采用多种方法检测不同组织在不同时间段IL-23，IL-17，TNF-α和IFN-γ的表达水平，将抗IL-23p19抗体腹腔注射治疗炎症性肠病模型小鼠，临床症状改善，炎症因子表达水平下降。本实验结果能够初步证实IL-23/Th17免疫轴参与炎症性肠病的发生，而且疾病的严重性与Th17细胞的数量呈正相关，抗IL-23p19抗体能够有效治疗炎症性肠病。　　材料和方法　　一、材料　　雄性BALB/C小鼠，SPF级，周龄8～10WK，体重22～25g，由中国医科大学实验动物中心提供，室内温度20±2℃，相对湿度为50％，自然光线采光，日照时间为12小时，常规饮水，普通专用饲料喂养。　　二、主要试剂　　2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)（美国sigma公司）;IL-23和IL-17免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，即用型SABC免疫组化染色试剂盒;细胞凋亡检测试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供;流式染色的试剂:PE标记的抗IL-17(PE-IL-17)，APC标记的抗IL-23(APC-IL-23)，FITC标记的抗IFN-γ(FITC-IFN-γ)，FITC标记的抗CD4(FITC-CD4)，PE标记的抗CD4(PE-CD4)，均购于美国BD/Pharmingen公司;ELISA试剂盒（IL-17，TNF-α，IFN-γ），购于上海森雄科技实业有限公司;SYBRPrimeScriptReal-TimePCRKit(TakaRa，DRR063s，大连宝生物工程有限公司);目的基因和内参引物DNA，（TakaRaCustomDNA，由宝生物工程（大连）有限公司设计）;细胞因子IL-6、TGF-β和rIL-23购于美国R&D公司;抗IL-23p19抗体，购于Biolegend公司;PRMI-1640培养基，10％胎牛血清，购于Hyclone公司。　　三、主要仪器和设备　　倒置显微镜;低温高速离心机(Eppendof);超低温冰箱;超净工作台;流式细胞仪(FACSCalibur，BDBioscience);全自动ELISA分析仪(BioTek，ELx808);LightCyclerRealTimePCR扩增仪(Roche)　　四、实验方法　　（一）建立BALB/C小鼠炎症性肠病模型　　用5％TNBS/乙醇溶液灌肠，将抗IL-23p19抗体腹腔注射到模型小鼠的体内，观察治疗前后小鼠一般情况的变化（包括腹泻、血便、体重），用HE染色鉴定小鼠结肠上皮的炎症改变。　　（二）免疫组织化学　　用免疫组化的方法检测造模前后小鼠结肠组织中IL-23和IL-17的表达，用凋亡试剂盒检测治疗前后小鼠结肠上皮细胞的凋亡，实验操作按照试剂盒说明。　　（三）小鼠肠系膜淋巴结细胞和脾淋巴细胞的制备　　将小鼠处死后分别取出脾脏和肠系膜淋巴结，通过机械研磨的方法制成单细胞悬液，PBS清洗，离心，取少许细胞悬液计数及活性测定。　　（四）体外培养小鼠肠系膜淋巴结细胞和脾淋巴细胞　　1、配制培养基:改良型RPMI-164090ml+10％胎牛血清10ml+庆大霉素4000u，其中RPMI-1640培养基和胎牛血清已经过灭菌处理。　　2、取24孔培养板，每孔加入培养基1ml，然后分别加入脾淋巴细胞和肠系膜淋巴结细胞，250μl/孔，约含有105个细胞，充分混匀。　　3、根据实验的需要单纯培养或加入不同的刺激因子混合培养。　　4、将培养板置于37℃CO2温箱中孵育48小时。　　5、每孔取上清液约200μl，移入EP管中，-70℃保存。　　（五）流式细胞术　　将培养48小时的肠系膜淋巴结细胞和脾淋巴细胞用流式细胞术检测CD4，IL-23，IL-17和IFN-γ的表达，实验操作按照试剂盒说明。　　（六）ELISA　　培养上清液中细胞因子IL-23，IL-17，TNF-α和IFN-γ的含量用ELISA法检测，实验操作按照试剂盒说明。　　（七）Real-TimePCR　　不同组织（结肠组织、肠系膜淋巴结细胞和脾淋巴细胞）在不同时间段IL-23，IL-17，TNF-α和IFN-γ的表达用Real-TimePCR的方法检测，实验操作按照试剂盒说明。　　（八）统计分析　　所有数据采用Mean±SD来表示，计算采用SPSS13.0软件进行分析，比较采用独立样本的t检验，p＜0.05差异有统计学意义。　　实验结果　　1、TNBS可以成功诱导出炎症性肠病动物模型　　2、模型小鼠结肠组织中IL-23和IL-17的表达明显增加　　3、与对照组相比，模型组小鼠结肠粘膜和肠系膜淋巴结细胞中IL-23、IL-17和TNF-α的表达明显增加，以造模后第3天的表达为最高，其中IL-23的表达要高于IL-17，但在脾淋巴细胞中这三种炎症因子的表达水平与对照组相似。　　4、与对照组相比，模型组小鼠结肠粘膜和肠系膜淋巴结细胞中IFN-γ几乎不表达，但在造模后第7天的脾淋巴细胞中IFN-γ呈高水平表达。　　5、抗IL-23p19抗体可以有效改善炎症性肠病动物模型的症状，治疗后结肠粘膜凋亡小体的数量减少，IL-23、IL-17和TNF-α的表达下降，对IFN-γ的表达几乎没有影响。　　6、分离造模后第三天的小鼠肠系膜淋巴结细胞，将其分组与多种刺激因子共同体外培养，其中加入IL-6、TGF-β和rIL-23组的IL-23、IL-17和TNF-α的表达水平远高于加入rIL-23组，加入抗IL-23p19抗体组的IL-23、IL-17和TNF-α的表达水平最低。　　讨论　　炎症性肠病（inflammatoryboweldiseases，IBD）是一种复杂的多因素疾病，包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，是一组原因不明的肠道慢性非特异性炎症，目前的观点认为适应性免疫系统识别肠道常驻菌群或者固有免疫系统与肠道常驻菌群发生异常的免疫反应在炎症性肠病发病机制中起着重要作用。在免疫反应中CD4+T细胞作为辅助性T细胞，协助其他炎性细胞发挥各种效应功能，启动免疫应答。幼稚T细胞在接受特定信号刺激下可以分化成为不同类型的辅助性T细胞，目前主要是Th1、Th2、Th17和Treg这四种T细胞亚群，每种T细胞亚群分泌不同的细胞因子，使其在适应性免疫应答中发挥重要作用。Th1细胞分泌高水平的IFN-γ以清除胞内病原体;Th2细胞表达IL-4，IL-5和IL-13有利于宿主清除寄生虫和蠕虫感染;Treg分泌TGF-β和/或IL-10，抑制辅助性T细胞增殖及其功能，以维持免疫稳态或下调感染后的免疫应答，辅助性T细胞功能失调后可以浸润IBD的胃肠道。随着研究的深入，最近人们发现了IL-17细胞因子家族，以及IL-23介导的分泌IL-17的T细胞扩增，这组不同的T细胞亚群被命名为Th17细胞亚群，目前研究发现Th17细胞与许多自身免疫性疾病的发病有关。　　本实验采用5％TNBS/无水乙醇（按体积比为1∶1）灌肠，诱导BALB/C小鼠建立炎症性肠病动物模型，该模型的机制是乙醇破坏肠粘膜屏障，TNBS作为一种有机酸半抗原渗入结肠组织，与组织蛋白等高分子物质结合，形成全抗原，使T淋巴细胞致敏，导致一系列免疫反应。实验组小鼠灌肠后1分钟左右即出现腹泻(65％)，表现为血性稀便(45％)，腹式呼吸，伏卧，不动，不觅食，个别小鼠出现抽搐，死亡率55％，24小时后小鼠状态开始好转，有活动和觅食，血便（包括便潜血阳性）持续一周左右（主要集中在前四天），到第七天基本恢复正常。体重下降出现在第一周，实验组小鼠造模后第三天体重是造模前的82.95％，p＜0.05，对照组小鼠灌肠后第三天体重是原来的95.19％，p＞0.05;实验组小鼠造模后第五天体重是造模前的90.64％，与造模后第一天的体重接近，对照组小鼠灌肠后第五天体重是原来的109.52％，较灌肠后第一天增加。分析以上的实验数据发现模型组小鼠造模后第三天的DAI最高，p＜0.05，同时体重下降的百分比也最多p＜0.05，因此TNBS诱导的结肠炎动物模型为急性肠道炎症，炎症持续时间为一周，但以第三天为最严重。光学显微镜下炎症累及粘膜和粘膜下层，重者可深达肌层，表现为粘膜充血、水肿、出血，上皮脱落、坏死、溃疡形成，粘膜和粘膜下层毛细血管扩张，有炎症细胞浸涧。小鼠结肠粘膜的病理表现与DAI评分和体重变化相一致。由此可见TNBS/乙醇灌肠可以成功诱导IBD动物模型，该模型属于Th1细胞介导的肠道免疫反应，其病理特征类似于人类克罗恩病。此模型特异性高，重复性好，已经引起学者的广泛关注，成为目前诱导克罗恩病模型的主要方法。　　我们通过多种方法(包括免疫组化、流式细胞术、ELISA和RT-PCR)检测小鼠结肠粘膜、脾淋巴细胞和肠系膜淋巴结细胞在造模后第1、3、5、7天IL-23、IL-17和IFN-γ的表达，模型组小鼠结肠粘膜和肠系膜淋巴结细胞中IL-23和IL-17的表达均高于对照组，p＜0.05，在造模后第三天表达最高，p＜0.05，而且结肠粘膜中IL-23和IL-17的表达要高于肠系膜淋巴结细胞，p＜0.05;而模型组小鼠结肠粘膜和肠系膜淋巴结细胞中IFN-γ的表达与对照组相比无明显差别，p＞0.05。模型组脾淋巴细胞中IL-23和IL-17的表达与对照组相比无明显差别，p＞0.05，而模型组小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达在造模后第七天才开始升高，p＜0.05;而模型组小鼠结肠粘膜和肠系膜淋巴结细胞中IFN-γ的表达与对照组相比无明显差别，p＞0.05。抗IL-23p19抗体可以有效地改善模型小鼠的状态，腹泻和血便减轻，体重下降的程度较治疗前减轻，而且治疗后模型小鼠结肠粘膜中IL-23和IL-17的表达明显下降，凋亡小体的数量减少。上述实验结果说明了Th17细胞在炎症的早期病变局部表达增加，随着疾病的进展，Th1细胞占优势，在清除病原体的同时也带来了炎症反应。将抗IL-23p19抗体腹腔注射治疗炎症性肠病模型小鼠，临床症状改善，炎症因子表达水平下降。在体外培养造模后第3天的肠系膜淋巴结细胞时施加一些干预因素，证实了IL-6和TGF-β是Th17细胞分化所必需的，IL-23不直接促进Th17细胞亚群的分化，但对已分化的Th17细胞起作用，参与炎症介质的级联放大，使IL-17和TNF-α表达增加，其中以表达IL-17为主，进一步证实了TNBS诱导的炎症性肠病与Th17细胞亚群密切相关。另外体外实验发现IL-23与Th17细胞共同培养能够维持这些细胞的表型，在IL-23缺失的情况下Th17细胞数量减少，这说明IL-23可能参与维持并稳定Th17应答。　　结论　　1、IL-23仅在TNBS致小鼠炎症性肠病动物模型的炎症局部高水平表达，对全身免疫系统没有影响;　　2、Th17细胞在炎症的早期发挥作用，Th1细胞可以维持炎症的发生发展;　　3、体外实验证实，IL-6和TGF-B是诱导CD4+T细胞分化成为Th17细胞的必需因子，IL-23可以协同IL-6和TGF-β促进Th17细胞的分化，并增强其致病性;　　4、抗IL-23p19抗体能够改善TNBS诱导的炎症性肠病模型小鼠的症状;　　5、IL-23/Th17免疫轴在小鼠炎症性肠病的发病机制中起着关键的作用，是治疗炎症性肠病的新的靶点。