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亨廷顿病(Huntington’s Disease)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病,由HD基因突变所致。HD基因编码亨廷顿蛋白(huntingtin, Htt).突变HD基因第一外显子中的CAG重复序列异常增加(超过35次),其编码的Htt氨基末端中的谷氨酰胺重复序列因此异常扩展。在HD患者、HD细胞模型和HD转基因动物模型中,突变Htt在细胞内错误折叠形成不可溶的聚集物,这种聚集物在HD发病中具有重要作用。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内主要的蛋白水解酶体系,能清除错误折叠蛋白,保护细胞免受聚集物的损害。UPS在降解错误折叠蛋白过程中,首先将要降解的蛋白质(底物)泛素化,泛素连接酶(ubiquitin ligase)E3是泛素化过程的关键酶之一,介导活化的泛素从泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme)E2转移到底物,具有识别底物的作用。E3可分为HECT(homologous to E6AP C terminus)家族和RING-finger家族。RING-finger家族是由多种蛋白构成的功能活性复合体,数目庞大,结构复杂。Cullin-RING复合体是RING-finger家族的主要成员,主要有SCF (Skpl cullinF-box, SCF)、ECS(ElonginC-Cu12 SOCS,ECS)和Cul3-based三种复合体类型。其中Cul3-based复合体(Cul3-based E3)由RING蛋白、Cul3和BTB-Kelch蛋白组成,BTB-Kelch蛋白具有接头蛋白的作用,决定底物蛋白的特异性。神经外胚层皮质1(Ectodermal Neuronal Cortex 1, ENC1)又称为脑细胞核限制性蛋白(nuclear-restricted protein/brain, NRP/B),其氨基末端含有BTB结构域,羧基末端有六个重复的Kelch结构域,是一种BTB-Kelch蛋白。ENC1与其他BTB-Kelch蛋白一样,可作为底物接头蛋白参与构成Cu13-based E3,并靶向调节底物蛋白泛素化和降解。多种E3能识别突变Htt介导其通过UPS降解,E3表达水平的改变导致UPS功能损害可使突变Htt降解障碍而在细胞内大量累积并产生细胞毒性。ENC1能否作为Cul3-based E3中的底物接头蛋白促进突变Htt泛素化并介导其被UPS降解,目前未见报道。本研究在检测突变Htt与ENC1相互作用的基础上,分析了不同ENC1表达水平对突变Htt泛素化、蛋白酶体依赖性降解和细胞毒性的影响,并观察了突变Htt对ENC1表达的影响。1.ENC1减少促进突变Htt聚集物我们观察了不同表达水平ENC1对突变Htt聚集物的影响。在荧光显微镜下观察发现,过表达ENC1可使转染表达160Q-Htt的N2a细胞中突变Htt聚集物数量明显减少,而用ENC1 SiRNA沉默ENC1则使转染表达160Q-Htt的N2a细胞中突变Htt聚集物数量明显增加。免疫印迹检测显示,过表达ENC1明显降低转染160Q-Htt的N2a细胞中聚集型和非聚集型突变Htt,而沉默ENC1则使聚集型和非聚集型突变Htt均明显增加；RT-PCR检测证明,过表达或沉默ENC1均不改变突变Htt的表达。ENC1促进突变Htt降解减少聚集物形成。2.ENC1抑制突变Htt的细胞毒性为了明确ENC1是否通过促进突变Htt的降解而抑制突变Htt的细胞毒性,用流式细胞术和caspase-3活性的免疫印迹分析检测了不同ENC1表达水平对突变Htt细胞毒性的影响。将分别转染表达20Q-Htt和160Q-Htt的N2a细胞过表达ENC1或沉默ENC1,以PI染色标记死亡细胞,流式细胞术分析显示,过表达ENC1虽不影响表达20Q-Htt细胞的死亡率,但明显降低表达160Q-Htt细胞的死亡率；沉默ENC1对表达20Q-Htt细胞和表达160Q-Htt细胞的死亡率均有增加,但对表达160Q-Htt细胞的死亡率增加更为明显。免疫印迹检测显示,过表达ENC1可抑制突变Htt对caspase-3的激活,沉默ENC1则促进caspase-3的激活。由此表明,ENC1对突变Htt的细胞毒性具有抑制作用。3.ENC1与突变Htt相互作用为明确ENC1能否与突变Htt相互作用,首先应用免疫荧光染色和免疫共沉淀技术观察了ENC 1与突变Htt的相互关系。免疫荧光染色显示,在转染正常Htt(20Q-Htt)的N2a细胞中,转染表达的20Q-Htt和内源性ENC1均弥散分布在细胞质内；在转染突变Htt(160Q-Htt)的N2a细胞中,转染表达的160Q-Htt在部分细胞内形成聚集物,并可见内源性ENC1与突变Htt聚集物共定位。免疫共沉淀分析显示,内源性ENC1在转染表达20Q-Htt的细胞中不能被HA-Htt抗体共沉淀,但能在转染表达160Q-Htt的N2a细胞中被HA-Htt抗体共沉淀,且被沉淀的ENC1分子量略大于ENC1正常分子量；在20Q-Htt或160Q-Htt与ENC1共转染的N2a细胞中,仅160Q-Htt能被Myc-ENC1抗体共沉淀。由此表明,ENC1与突变Htt具有相互作用,ENC1可能因自身泛素化而分子量增大。4. ENC1促进突变Htt泛素化及蛋白酶体途径降解为了明确与突变Htt相互作用的ENC1能否作为一种E3促进突变Htt的泛素化,同时观察了不同ENC1表达水平对突变Htt泛素化的影响及突变Htt蛋白酶体性降解。免疫印迹分析显示,过表达ENC1明显增加细胞总蛋白泛素化水平,而用ENC1-SiRNA沉默ENC1后,细胞总蛋白泛素化水明显降低。过表达ENC1且共转表达160Q-Htt的N2a细胞中,用HA-Htt抗体免疫共沉淀的突变Htt泛素化明显增强,过表达ENC1促进突变Htt降解的作用可被MG132抑制。ENC1-沉默且共转表达160Q-Htt的N2a细胞中,用抗HA-Htt抗体免疫沉淀的突变Htt泛素化水平也明显降低,沉默ENC1抑制突变Htt降解的作用可被MG132加强。由此证明,ENC1能通过与突变Htt的相互作用促进突变Htt的泛素蛋白酶体途径降解。5.突变Htt抑制ENCl的表达Htt的突变可影响多种基因的表达。为了明确突变Htt是否影响ENC1的表达,对HD)转基因小鼠和表达突变Htt的N2a细胞内ENC1表达的影响。免疫印迹检测发现,HD转基因小鼠脑内ENC1蛋白水平较野生型小鼠明显降低,转染表达160Q-Htt的N2a细胞内ENC1蛋白水平较转染表达20Q-Htt的N2a细胞降低；RT-PCR检测进一步发现,HD转基因小鼠脑内ENC1 mRNA水平较野生型小鼠明显降低,转染表达160Q-Htt的N2a细胞内ENC1 mRNA水平较转染表达20Q-Htt的N2a细胞降低。由此表明,突变Htt能抑制ENC1的表达。为了进一步明确突变Htt是否通过抑制ENC1的表达抑制细胞内UPS功能,继而应用稳定表达含有蛋白酶体降解信号CL1的EGFP (GFPu)的HEK293细胞,比较了过表达ENC1对突变Htt抑制GFPu降解作用的影响。免疫印迹检测证明,转染表达160Q-Htt可明显抑制GFPu的降解,过表达ENC1可翻转160Q-Htt抑制GFPu降解的作用,MG132可阻断过表达ENC1翻转160Q-Htt抑制GFPu降解的作用。结论：ENC1通过特异性识别突变Htt而影响突变Htt的泛素化水平,促进突变Htt泛素蛋白酶体途径清除,减少突变Htt聚集,保护蛋白酶体活性,减少突变Htt诱导的细胞死亡。突变Htt通过抑制ENC1表达而损害UPS功能。