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目的:建立6种呼吸道副粘病毒(人偏肺病毒:HMPV;呼吸道合胞病毒A型与 B 型:RSV-A、RSV-B;副流感病毒 1、2、3 型:PIV-1, PIV-2, PIV-3)的2管多重荧光定量RT-PCR检测方法;对一种商品化的多重检测试剂盒RespirFinder?2SMART进行应用评价;分析青海急性呼吸道感染(acute respiratory infection,ARI)鼻咽拭子样本的呼吸道病原谱与其流行病学特征。方法:查找并设计6种常见人副粘病毒检测引物及Taqman探针,优化反应条件,确定单管三重的组合方案,建立检测6种副粘病毒的2管多重荧光定量RT-PCR检测方法。收集从青海省发热呼吸道症候群(FRS)哨点监测医院采集的鼻咽拭子(NPAs)共471份,采用建立的多重荧光定量RT-PCR检测方法对该批样本进行6种常见人副粘病毒的检测与流行病学特征分析。商品化的多重呼吸道病原检测试剂盒(RespirFinder?2SMART kit)可以同时检测22种病原,包括18种病毒,4种细菌。我们采用该检测试剂盒对上述青海省鼻咽拭子样本进行检测,同时利用本实验室前期建立的12种呼吸道病原的分子检测方法(包括人冠状病毒多重荧光定量RT-PCR、人腺病毒荧光定量PCR、人鼻病毒荧光定量RT-PCR及6种常见人副粘病毒多重荧光定量RT-PCR)进行平行检测与结果比较分析,进一步采用巢式PCR或荧光定量PCR的方法对检测结果不一致的样本进行检测与测序验证,同时评价RespirFinder?2SMART多重呼吸道病原检测试剂盒的应用效果。最后综合上述检测结果与分析,获得青海省发热呼吸道症候群(FRS)哨点监测医院采集的该批样本较为全面的呼吸道感染病原谱及相关流行病学特征。结果:第一部分六种常见呼吸道副粘病毒2管多重荧光定量RT-PCR检测新方法的建立及应用分析六种常见人副粘病毒(HMPV,RSV-A,RSV-B,PIV-1,PIV-2,PIV-3)在各自多重反应体系中的检测下限与相应的单重反应体系检测下限一致,均可达到10拷贝/μl,各型别病毒的标准曲线线性区间在l01copies/μl至107copies/μl数量级之间,决定系数R2在0.99以上;组内与组间重复试验的循环阈值(Ct)的变异系数(CV)最大为3.95%。本研究建立的六种常见人副粘病毒2管多重反应体系未见非特异性扩增,与其他常见呼吸道病毒A型流感病毒(InfA)、B型流感病毒(InfB)、人冠状病毒(HCoV-229E、-OC43、-NL63、-HKU1))、鼻病毒(HRV)、人腺病毒(HAdV)和博卡病毒(HBoV)阳性样本无交叉反应;471份发热呼吸道NPAs检测结果显示六种副粘病毒的多重荧光定量RT-PCR与其相应单重荧光定量RT-PCR具有良好一致性。采用本研究建立的六种常见人副粘病毒2管多重反应体系检测青海省445份具有有效临床信息的ARI鼻咽拭子样本,结果显示:HMPV、RSV-A、RSV-B、PIV-1、PIV-2、PIV-3 的检出率分别为 0.44% (2/445)、3.15% (14/445)、0.22%(1/445)、2.70% (12/445)、2.70% (12/445)、2.02% (9/445)。445 份 NPAs 中至少一种副粘病毒阳性样本有42份,占9.44%。其中单独感染35份,混合感染7份。单独感染中以RSV-A最多,共11份,占26.19% (11/42)。在病毒混合感染中,既有双重混合感染(4份,9.52%),也有三重混合感染(3份,7.14%)。各型别病毒阳性样本主要集中小于5岁以下及65岁以上年龄组。其中HMPV阳性患者中位年龄最大,为76岁,PIV-3阳性患者的中位年龄最小,为3岁。各型别病毒在性别分布中的检出率差异均无统计学意义。从季节来看,PIV-3和PIV-2主要在春季检出,PIV-1、RSV-A及RSV-B主要在冬季检出。HMPV共检出2例,分别分布在夏季和秋季。大部分副粘病毒感染的阳性病例体温中位数大于38℃,但RSV-B及HMPV感染者的体温中位数小于38℃。第二部分RespiFind?2SMART多重病原检测试剂盒的应用评价RespirFind? 2SMART多重检测试剂盒覆盖常见的22种呼吸道病原,包括18种病毒和4种细菌,具有体系配置简便,检测时间短等特点。基于本实验室建立的分子检测方法(in-house assays),与471份来源于ARI的临床样本,采用RespirFind? 2SMART多重检测试剂盒与in-house assays对12种呼吸道病毒进行了平行检测和分析,包括4种人冠状病毒(HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-HKUl)、人腺病毒(HAdV)、人鼻病毒(HRV)及6种常见人副粘病毒(PIV-1、PIV-2、PIV-3、HMPV、RSV-A 和 RSV-B)。试剂盒所包含 22 种病原均能检出,但检出例数不一,其中在病毒病原中A型流感病毒(InfA)检出最多,细菌病原中肺炎支原体(M.pneu)检出最多。RespirFind? 2SMART多重试剂盒检测结果与12种呼吸道病毒in-house assays检测结果完全一致的包括:HMPV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1、PIV-3、RSV-B,灵敏度均为 100%。而两种检测手段结果存在差异的病原包括:RSV-A、PIV-1、PIV-2、HCoV-229E、HAdV、HRV,灵敏度分别为 64.28%、58.33%、57.14%、未计算、100%、100%;其中RespirFind? 2SMART多重检测试剂盒检测RSV-A、PIV-1、PIV-2的阳性数低于in-house assays检测结果(分别少了 5例、5例和6例),进一步采用巢式PCR的方法对RSV-A、PIV-1、PIV-2检测结果不一致样本进行确认,分别确认了 5/5、0/5、0/6为阳性;而RespirFind? 2SMART多重检测试剂盒检测 HCoV-229E、HAdV和HRV的阳性数高于in-house assays检测结果(分别多了 2例、13例和17例),进一步采用巢式PCR及序列测定的方法对HAdV、HRV检测结果不一致样本进行确认,分别确认了 6/13、12/17为阳性,而采用单重荧光定量PCR方法对2例HCoV-229E不一致样本进行确认,确认了其中1例为阳性。综合实验室检测结果及试剂盒检测结果对445份具有临床信息的样本的病原谱及相关流行特征进行分析。结果显示:任一呼吸道病原检出阳性的样本有226份,占51%;其中仅检出一种病毒或细菌感染样本有147份,占33%;病毒混合感染有55份,占12%;病毒与细菌混合感染有24份,占6%; 22种病原中检测最多依次为流感病毒(IFV(infA、infB、HlNlpdm09))、HAdV、PIV (-1,-2,-3,-4)、HCoV (-229E,-NL63, -HKU1,-OC43)、HRV/HEV 和肺炎支原体(M.pneu),相应病原检出率依次为 27.64%( 123/445)、12.58%(56/445)、8.76%(39/445)、8.09% (36/445)、7.42% (33/445)和 6.29% (28/445)。嗜肺军团菌(L.pneu)及百日咳杆菌(B.pert)为1份和2份。除HBoV外,其余病原超过50%的阳性检出是合并感染。对IFV, HCoV, HAdV,HRV/EV,M.pneu 进行流行特征分析。除 HAdV(中位年龄13岁)外,其余各病原的中位年龄均大于18岁,IFV主要分布在0～1岁年龄组,HAdV在5～18岁年龄组,HCoV主要分布在18～40岁年龄组。除HRV/HEV在门急诊病例与住院病例的检出率差异有统计学意义外,其余各病原在男女及门急诊与住院中的检出率差异均无统计学意义。临床特征显示各病原感染主要以咳嗽症状为主,平均体温均在38℃以上。时间分布显示IFV具有三个明显检出高峰,分别在1月(11例)、7月(18例)、9月(24例);HAdV有两个相对较高的检出峰,分别在1月(8例)和12月(10例),HRV/HEV的检出高峰则在4月(4例)和7月(7例)。M.pneup阳性病例则主要分布在9月、10月、11月。HCoV表现出明显的高峰,位于7月,共有病例11例。HRV/HEV,在4月和7月是是两个检出高峰,分别为4例和7例,而其余月份相对较少。结论:1、本研究建立了一种新的检测常见6种副粘病毒的2管多重荧光定量RT-PCR方法,并且在临床样本检测中效果同相应的单重荧光定量RT-PCR效果相当,灵敏、特异、稳定性好。对青海发热呼吸道鼻咽拭子样本中6种副粘病毒检测结果表明:6种副粘病毒整体检出率为9.44% (42/445),其中RSV-A检出最高,为 3.15% (14/445)。2、RespirFind? 2SMART Kit与本实验室12种呼吸道病毒检测方法平行比较结果表明:该试剂盒对HCoV、HAdV、HRV的检测灵敏度高,但对副粘病毒的检测灵敏度略低。采用RespirFind? 2SMART Kit可从青海发热呼吸道鼻咽拭子样本中检出试剂盒所包含22种病原。3、对青海发热呼吸道感染455份鼻咽拭子样本的病原谱分析结果表明:检出阳性的样本有226份,占51%;其中以流感病毒检出最多,为27.64%( 123/445)。流行病学特征显示不同病原在不同年龄组分布不同,并存在不同的时间流行特点。