甘蔗(Saccharum spp.)是最重要的糖料作物,虫害是影响甘蔗产量、品质和宿根年限的主要限制因素之一,其中螟虫危害最为严重,并具有全生长季危害的特点,对产业造成严重损失。与大多数作物一样,甘蔗基因池中缺乏抗虫基因,加上甘蔗遗传背景复杂,因此,传统杂交育种培育抗虫品种难度大,导致甘蔗栽培品种抗虫性差。转cey1Ac基因在玉米、棉花等作物抗虫性改良上效果显著并已大面积商业化应用,且其安全性已经得到证实,因此,通过转基因技术改造甘蔗抗虫性,培育抗虫品种并创制可用于杂交利用的抗虫种质是目前最为有效的途径。甘蔗又是工业原料作物和营养繁殖作物,转基因安全风险等级为最低(I级),而蔗糖结晶经过107℃高温过程,并未在转基因甘蔗加工而成的蔗糖中检出外源基因成分或蛋白成分,因此,转基因甘蔗的商业化应用值得期待。本研究以基因枪轰击获得的转cry1Ac基因甘蔗群体为实验材料,开展了外源基因成分特异、高效、灵敏的检测技术研究以及对抗性拟转基因甘蔗株系进行了真实性鉴定,奠定了转基因甘蔗深入研究的重要基础性工作;而外源基因的相对低拷贝是外源基因稳定整合和适度表达的前提,甘蔗上是否也有类似情况尚未可知。考虑到甘蔗基因组高达10Gb且倍性复杂,生物素标记的Southern杂交信号弱、效果差,我们建立了高效、安全稳定的外源基因拷贝数鉴定技术,实现了对转基因群体外源基因的拷贝数的高效低成本鉴定;继而探究了转基因甘蔗株系的遗传稳定性及外源基因的插入位点或旁侧序列,探究了转基因群体cry1Ac蛋白的时空表达特性等,对后续系统生物学研究具有重要意义。在此基础上,对外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质性状和抗虫性进行了关联分析,以期探索转cry1Ac基因甘蔗的分子特征与生物学特性之间的关系,并对外源目的蛋白表达对甘蔗根际土壤微生态中微生物的影响进行了评价。进一步,通过典型转基因株系与非转基因对照的RNA-seq转录组学分析转基因的非预期效应,试图从分子和基因整体水平上,揭示抗虫转基因甘蔗及其受体FN15非转基因甘蔗相关代谢和信号通路应答机制的差异,从而解析生物学特性差异的分子基础。该研究具有重要的科学意义和实际应用价值。本研究得到国家自然科学基金项目(No.31271782)和福建农林大学优秀博士学位论文基金(No.1122YB015)的资助。相关研究的主要结果与结论如下:1.基于环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术原理,针对转基因甘蔗外源目的基因cry1Ac序列(GenBank:KF630361.1)和bar基因序列(GenBank:EU048867.1)设计特异性的LAMP扩增引物,优化了 cry1Ac-LAMP的主要体系成分,25.0μL反应体系含有:5.25mMMg2+、4:1的内外引物比、2.0U的M大片段DNA聚合酶,其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限为43.1 copies的质粒1Ac0229和1.0 ng·μL/-1的转基因甘蔗(cry1Ac拷贝数为21.89 copies·cell-1)基因组DNA。bar-LAMP优化后的25.0μL反应体系含有:5.25 mMMg2+、6:1的内外引物比、6.0 U的Bst大片段DNA聚合酶;其敏感性较常规PCR灵敏10倍,检测限是10 copies的质粒1Ac0229;特异性探究实验发现cry1Ac-LAMP和bar-LAMP只能检测到含有特异cry1Ac基因或bar基因的甘蔗样品,拟转基因系的应用检测试验发现所建立的方法cry1Ac-LAMP和bar-LAMP技术是可靠的。结果表明,建立的cry1Ac-LAMP和bar-LAMP检测技术方法特异性强、灵敏度高、快速省时、结果可靠,可视化检测尤其适用于转基因甘蔗的田间现场筛查检测与监管,具有很好的应用价值和推广前景。2.基于前人报道腺苷 5-磷酰硫酸还原酶(Adenosine 5’-phosphosulfatereductase,APRT)、细胞周期素(Cyclin,CYC)和脯氨酰-4-羟化酶(Prolyl4-hydroxylase,P4H)三个基因是甘蔗潜在的具有高特异性和低拷贝数内标准基因。我们克隆了APRT、CYC和P4H基因并构建了多元内标准基因靶标标准质粒(p1AcAPC),建立了基于这个标准质粒的TaqMan实时荧光定量PCR技术,对转cry1Ac基因的抗性再生甘蔗植株群体的拷贝数进行了鉴定。该方法具有高特异性和高敏感性,检测操作简便,效率高等特点,其定量结果不仅可作为转cry1Ac基因甘蔗真实性鉴定的佐证,更主要的是可以实现快速鉴定转基因甘蔗的拷贝数,相关研究也是转cry1Ac基因甘蔗遗传稳定分析及后续系统生物学研究的基础。3.外源基因拷贝数、转基因甘蔗产量、品质和抗虫性进行关联分析的研究结果与结论如下:(1)外源目的基因cry1Ac以中等拷贝数导入和整合,有利于抗虫目标性状改良,并增加获得对非目标性状影响不大的转化事件的几率,可能是由于现代甘蔗栽培种至少为八倍体,且染色体数目约为120条,基因组达10 Gb,因此,低拷贝数外源目的基因的导入和整合,其所表达的蛋白对抗虫目标性状的改良效果不明显,这与二倍体物种如水稻等有较大的不同,但高拷贝的导入和整合又导致非目标性状如甘蔗产量和品质性状变劣。此外,我们还观察到蛋白表达与外源基因拷贝数之间没有确定的线性关系或剂量效应;(2)在FN15为受体的转基因系群体中,中拷贝型的转基因株系表现出更好的产量与品质性状表型,并从中筛选到1个(a1株系)单位面积产糖量优于非转基因对照、2个(a5和a6株系)与对照相当但螟害率显著低于对照的株系,待完成安全性评价后,有望直接作为甘蔗生产性品种利用或作为杂交亲本用于甘蔗抗螟虫育种。4.转基因甘蔗的蛋白时空表达情况,其研究结果如下:(1)FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在甘蔗不同的组织部位的表达均呈现出蔗叶中表达量最高、根次之、茎中最低的趋势;(2)FN15受体转基因群体和ROC22受体转基因群体,cry1Ac蛋白在不同生长阶段的表达呈现出分蘖期最高、成熟期次之、拔节期最低的趋势;(3)根中的cry1Ac蛋白表达情况最为复杂:FN15受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出成熟期最高、拔节期次之、分蘖期最低的趋势;而ROC22受体转基因系中,蔗根中cry1Ac蛋白表达呈现出分蘖期最高、拔节期次之、成熟期最低的趋势;(4)对于FN15受体的转基因株系,中拷贝型的al和a5株系在各生育期其cry1Ac表达量均高于低拷贝型的19b-2和19b-4株系;而ROC22为受体的转基因株系,则没有这个趋势。发现转cry1Ac基因甘蔗外源cry1Ac蛋白存在一定的动态时空表达特性,并具有受体基因型的差异。5.通过单引物PCR、Genome walking试剂盒(TaKaRa)和hi-Tail PCR等三种方法,对转cry1Ac基因甘蔗外源基因插入位点进行了研究。研究发现,单引物PCR法特异性较低;Genome walking试剂盒(TaKaRa)获得克隆条带过大(约5 Kb)、加上随机引物(AP)为混合物且为专利产品,给TA克隆测序带来了挑战、实验成本和周期长,不利于序列分析;hi-Tail PCR法中加入了 AC1及其LAD引物的巧妙设计,极大地提高了获得旁侧序列的能力。采用hi-Tail PCR法,成功鉴定了 a1株系左右边界和a5株系右边界的旁侧序列,发现基因枪法轰击转化的转基因甘蔗外源基因趋向于整合到线粒体等环状DNA中。6.通过PCR-DGGE法,对6个转cry1Ac基因甘蔗株系根际土壤微生态的微生物物群落和进化关系进行了研究,发现土壤微生物群落的变化是动态的,可能与生长时期、季节和环境等因素有关,但从整体和长期趋势来看,转基因系和非转基因系对土壤微生态的作用是一致的。7.转cry1Ac基因甘蔗及非转基因对照的RNA-seq转录组表达谱分析转基因甘蔗的非预期效应,其研究结果如下:(1)本研究RNA-seq测序与组装的质量高。12个甘蔗样品共获得了 83.50 Gb的数据量和668,017,350条的总reads数。组装得到的甘蔗Unigene库总共含有65,995条Unigenes,N50长度达到了 1,049 bp,平均组装长度为715.14 bp。(2)差异基因表达统计发现,上/下调表达情况较丰富,转基因系和非转基因系差异表达的基因总共有1,067个,共同上调表达的基因总共有199个,共同下调表达的基因总共有473个。(3)转基因系和非转基因系相比,上调表达基因的代谢途径主要涉及与植物次生代谢途径相关,有苯丙氨酸代谢途径、甘油酯代谢途径、亚油酸代谢途径、类黄酮生物合成和二萜生物合成途径等,其次是植物激素转导途径。下调表达基因的代谢途径主要涉及异羟肟酸生物合成等化学防御代谢途径,脂肪酸代谢等基础代谢途径以及植物激素信号转导、植物-病原互作等代谢通路。这些有关转基因甘蔗转录本潜在功能的分析,初步揭示了转基因甘蔗典型株系的抗虫性和其他表型性状形成的分子基础,而这些途径中与植物抗逆和防御相关的基因以及中、低拷贝型株系间的差异基因是后续深入研究的重点,不仅有助于揭示上述基因在甘蔗抗逆、防御和产量形成中的作用,还有助于指导培育抗虫性、产量和品质兼优符合育种目标的转基因新品系。