H9N2亚型禽流感病毒虽属低致病性流感病毒,我国自1994年于禽群中分离到H9N2亚型流感病毒以来,该亚型禽流感在多地出现并不断蔓延,严重影响了养禽业的健康发展。同时,该亚型禽流感病毒的宿主感染谱广泛且仍在不断拓宽,对公共卫生造成严重危害。基质蛋白（matrix protein 1,M1）作为病毒粒子中含量最为丰富的结构蛋白,其不仅保持了病毒粒子的完整性,而且在病毒生命周期的不同阶段发挥多种功能。通过比对H9N2病毒M1全长基因序列（n=2,201）,我们发现我国H9N2病毒在进化过程中,M1基因主要存在5种进化模式,更为重要的是,M1的模式差异与病毒的适应性和流行优势存在对应关系。进一步分析发现,存在于不同模式之间的差异位点主要位于M1与NEP结合区、M1的转录抑制区或M1与v RNP结合区,暗示这些差异位点可能对H9N2病毒生命周期有关的生物学功能产生趋异影响。因此,从M1蛋白的适应性着手,本研究首先合成了5种模式的M1基因序列,与p HW2000载体连接后应用反向遗传技术拯救出了5株具有不同M1模式的病毒。根据病毒在MDCK细胞的一步和多步生长动力学曲线,发现P5组的病毒滴度显著高于P3组（p＜0.05～0.0001）,而P2、P4、P1组与P3组相比无显著性差异（p＞0.05）。病毒的生长竞争试验结果显示,P5组的差异位点在SNP测序中占比达到74%。由此说明,在5种M1模式中,P5组的增殖能力和生长竞争能力显著高于其他各组。为了挖掘不同M1模式病毒增殖能力和生长竞争能力差异的内在原因,我们从病毒复制周期着手,进一步探究了M1在病毒复制不同阶段的生物学效应。首先,我们利用酸旁路试验直接诱导了病毒的脱壳,并结合双荧光素酶活性试验测定了5种M1模式病毒之间的脱壳能力差异。结果表明,P5、P4和P2组的脱壳能力显著高于P3（p＜0.05～0.0001）,而P1组与P3组相比无显著性差异（p＞0.05）。病毒聚合酶活性是决定vRNA复制与转录效率的关键因素,入核后的M1发挥调节聚合酶活性的功能。因此,我们利用双荧光素酶活性试验测定了病毒聚合酶活性。结果表明,P5和P4组的聚合酶活性极显著高于P3组（p＜0.001）,而P2、P1组与P3组相比无显著性差异（p＞0.05）。M1入核后能够适时终止病毒mRNA的继续转录,并协助v RNP出核。因此我们通过q PCR检测了mRNA水平,结果表明在4～10hpi,P5、P4组的mRNA水平显著高于P3组（p＜0.01～0.0001）,而在10～12hpi,P5、P4组的mRNA水平下降趋势比P3组更明显。据此推测,P5和P4组的转录效率在前期高于P3组,而在后期病毒的转录被适时终止,以便v RNP组装后能够快速出核。为了检测M1协助v RNP出核能力,我们分离了细胞核和细胞质组分,并通过q PCR检测了细胞核和细胞质中vRNA水平。结果表明,在4～8hpi,P5、P4和P2组细胞核内的vRNA水平极显著高于P3组（p＜0.001～0.0001）,P1组与P3组相比无显著性差异（p＞0.05）,而后在8～12hpi,P5、P4和P2组的vRNA水平逐渐趋于平缓,P1和P3组依旧呈现上升趋势;在细胞质中,P5、P4和P2组在8hpi、12hpi的vRNA水平极显著高于P3组（p＜0.0001）,P1组与P3组相比无显著性差异（p＞0.05）。由此证明在v RNP出核过程中,P5、P4和P2组的M1能够协助v RNP快速出核。在病毒组装和出芽过程中,我们利用Western blot定量检测了细胞质和细胞质膜组分中M1蛋白的含量,并进一步利用体外出芽试验检测了不同模式M1对病毒出芽能力的影响。结果表明,P5、P2和P4组M1与细胞质膜结合能力和出芽能力极显著高于P3组（p＜0.0001）,而P1组与P3组无显著性差异（p＞0.05）。总之,通过检测5种不同M1模式对病毒的脱壳、病毒聚合酶活性,病毒基因组转录、v RNP出核,病毒的组装和出芽的生物学效应,我们发现我国H9N2病毒的M1基因主要存在5种进化模式与病毒的适应性和流行优势存在着严格的对应关系,尤其是P5组在病毒复制周期中表现出了极为显著的复制优势,说明M1/P5是H9N2亚型禽流感病毒进化适应过程中的优势基因模式。因此,本研究揭示了M1基因的遗传多态性在H9N2病毒复制中的作用,对于科学评估H9N2病毒适应性差异及其流行优势更迭原因的分子机制提供了依据。