研究背景牙齿缺失是人一生中常见的口腔问题,牙齿缺失不仅会对人体健康产生影响,同时还会对患者面部美观、心理健康产生影响。传统的牙齿缺失修复方式即为义齿修复,但其在功能及感觉方面,都无法与天然牙相媲美。因而组织工程牙齿无疑被认为是将来解决牙齿缺失最为理想的方式。颅神经嵴源性的外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)被认为是除牙釉质外所有牙齿组织始祖生成细胞。本课题组前期研究发现,处于牙胚钟状期的EMSCs较其他时期的EMSCs具有更好的体外矿化能力。p75NTR(p75 neurotrophin receptor,神经营养因子受体)为神经营养因子低亲和力受体,不仅是颅神经嵴源性外胚间充质干细胞的经典表面标记物,同时还参与了细胞增殖、迁移、分化、生存、凋亡等生物学过程的调控。p75NTR参与神经系统的发生发育中的调控作用已被充分探究,但其参与神经系统以外组织(如肝脏、肌肉、脂肪、牙齿等)的发生发育过程的研究却仍处于起步阶段。尤其是在牙齿发育中的可能的调控作用鲜有报道。本研究借助于来源于美国Jackson实验室的p75NTR敲除小鼠,利用E18.5d处于牙胚钟状期的胚胎进行p75NTR(-/-)EMSCs及p75NTR(+/+)EMSCs的矿化分化能力差异的比较,探究p75NTR敲除对EMSCs矿化能力的影响,为进一步明确p75NTR影响EMSCs矿化发育可能的分子机制,揭示牙齿发生发育的分子生物学机制提供理论依据及实验支持。研究内容1、E18.5d颌突EMSCs的获取、培养、基因型鉴定和生物学特性检测将p75NTR(-/+)雌性小鼠及p75NTR(-/+)雄性小鼠配笼,常规饲养,小鼠从见阴栓午间为胚胎0.5d,并于孕18.5d时行2%戊巴比妥钠(50mg/kg)小鼠腹腔麻醉注射,5-10分钟后行腹腔手术,无菌条件下取出胚胎,于生物安全柜中PBS冲洗并切取颌突组织,尽量切碎组织使其为0.1mm*0.1mm*0.1mm的组织块,1%Ⅰ型胶原酶消化,中和离心,去除上清后加入约2ml含10%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的DMEMF12培养基,重悬于六孔板中,放置于含5%CO2的37℃孵育箱中培养。切取胎鼠的尾巴及四肢组织行基因型鉴定。并分别从细胞形态学、流式细胞检测细胞表面抗原及细胞周期等方面对两种基因型EMSCs进行检测、鉴定。2、E18.5d p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs矿化能力的检测分别对p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs进行体外矿化诱导,以检测其矿化分化能力的差异。矿化诱导液为10-8M地塞米松、50 g/L抗坏血酸、100ml/L胎牛血清及10 mmol/Lβ甘油磷酸钠配制的α-MEM培养液。每3天换一次液。分别矿化诱导第7天行ALP染色,第21天行茜素红染色,并分别收集诱导第7天、14天、21天的细胞RNA,以检测矿化相关基因ALP、Col I随矿化诱导的变化,明确p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs体外矿化诱导能力的差异。3、p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)小鼠骨矿化发育情况的研究选取同窝p75NTR(-/-)小鼠及p75NTR(+/+)小鼠,常规饲养至4个月。挑选雄性小鼠,以50mg/kg的2%戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉后,脱颈处死。剥脱分离左侧股骨,放于4%多聚甲醛中固定组织,借助Micro-CT(viva ct40 Scanco Medical AG;Brüttisellen,Switzerland)进行扫描,并利用其配套软件后期进行三维图像重建及数据分析;选取同窝p75NTR(-/-)小鼠及p75NTR(+/+)雄性小鼠,常规饲养40天时行钙黄绿素荧光标记实验,即每间隔5天注射钙黄绿素(25mg/kg,sigma),共4次,并于最后一次腹腔注射2天后脱颈处死小鼠,剥脱分离出小鼠左侧股骨,行硬组织切片,并观察计算荧光带之间的距离,计算出每种小鼠股骨各自的平均每天矿化沉积率(mineral apposition rate,MAR),单位为um/d;提取4周龄大p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)小鼠股骨总RNA及蛋白质,通过RT-PCR和Western blot法检测矿化相关基因ALP、Runx2的表达水平。结果1、(1)切除颌突组织后剩余组织进行基因型鉴定,结果在280bp处单条带者为p75NTR(-/-),345bp处单条带者为p75NTR(+/+),在280bp、345bp处双条带者为p75NTR(-/+)。(2)E18.5d的p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)EMSCs分别从相应的p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)胚胎颌突组织中获取,两种基因型EMSCs在细胞形态上均为明显的长梭形的成纤维细胞形态,无明显差异。(3)流式细胞检测细胞表面抗原检测结果:p75NTR(-/-)EMSCs的CD14(99.07%)、CD146(95.79%)、CD166(95.79%);p75NTR(+/+)EMSCs的CD14(97.57%)、CD146(96.32%)、CD166(97.90%)。两种基因型细胞的CD45均为阴性表达结果,分别为0.28%和0.50%。(4)细胞周期检测结果显示p75NTR(-/-)EMSCs的G1期(77.65%)、G2期(17.01%)、S期(7.56%);p75NTR(+/+)EMSCs的G1期(79.25%)、G2期(15.27%)、S期(8.90%),二者之间细胞周期无明显差异。2、(1)碱性磷酸酶染色结果:矿化诱导7d后,p75NTR(+/+)EMSCs组染色较p75NTR(-/-)EMSCs组深。(2)茜素红染色结果:矿化诱导21天后,各组均有矿化结节形成,p75NTR(+/+)EMSCs组染色较p75NTR(-/-)EMSCs组深,且矿化结节量多。(3)RT-PCR结果:矿化诱导7天、14天、21天后,各组提取总RNA,逆转录后进行PCR反应,结果发现矿化诱导7天、14天和21天时均为p75NTR(+/+)EMSCs组ALP表达水平明显高于p75NTR(-/-)EMSCs组(P﹤0.05);Col I也表现为相同结果(P﹤0.05)。3、(1)Micro-CT扫描4月龄大同窝p75NTR(-/-)和p75NTR(+/+)小鼠左侧股骨,扫描后经三维重建及数据分析结果:松质骨的BV(骨量),BV/TV(骨体积分数),Tb.N(骨小梁数),Tb.Th(骨小梁厚度),均为p75NTR(-/-)小鼠较p75NTR(+/+)小鼠为低,而BS/BV(骨表面积/骨量),Tb.Sp(骨小梁分离度),则为p75NTR(-/-)组小鼠高于p75NTR(+/+)组小鼠;同段股骨皮质骨的分析结果:Ct.TBTh(骨皮质厚度)及Ct.BV(骨皮质骨量)均为p75NTR(-/-)组小鼠较p75NTR(+/+)小鼠组为低,但Ct.BS/BV(骨表面积/骨量)则为p75NTR(-/-)组小鼠高于p75NTR(+/+)小鼠组。(2)钙黄绿素荧光标记检测结果显示p75NTR(-/-)组小鼠股骨的平均矿化速率明显低于同窝p75NTR(+/+)组小鼠(P<0.01);(3)PCR及Western blot结果显示p75NTR(-/-)组小鼠的ALP、Runx2基因表达水平明显较p75NTR(+/+)组小鼠组低(p<0.01)。结论1、通过两种基因型EMSCs的培养及矿化能力检测,发现p75NTR参与了小鼠外胚间充干细胞EMSCs的矿化分化能力的调控,并且p75NTR敲除对EMSCs的矿化分化能力存在负性调控作用;两种基因型细胞之间细胞周期无明显差异,说明p75NTR敲除后对EMSCs矿化分化能力负性调控作用的实现并不涉及细胞增殖能力、凋亡情况的改变。2、p75NTR敲除小鼠不表达具有结合NGF能力的p75NTR,Micro-CT检测、钙黄绿素荧光标记实验、RT-PCR及Western blot检测发现p75NTR(-/-)组小鼠股骨矿化形成能力明显低于p75NTR(+/+)小鼠组,因此我们初步猜测p75NTR对小鼠骨的矿化形成能力的调控是通过结合NGF实现的。