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目的: 检测GCF2对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响,明确GCF2调控的与肝癌细胞迁移侵袭相关靶基因,为进一步研究肝癌转移的可能机制提供理论基础。 方法: (1)以高表达GCF2的肝癌细胞株HepG2、BEL-7404和高转移肝癌细胞株MHCC97-H作为研究对象,采用siRNA技术沉默上述细胞株内GCF2的表达,利用Transwell迁移和侵袭实验研究沉默GCF2对肝癌细胞株迁移侵袭能力的影响。 (2)构建shRNA-GCF2慢病毒重组质粒,将重组质粒转入上述肝癌细胞株内,构建稳定沉默GCF2表达的肝癌细胞株。然后将沉默GCF2肝癌细胞注入裸鼠肝脏内,建立裸鼠原位种植人肝癌细胞模型,观察沉默GCF2表达对肝癌细胞在裸鼠体内转移的影响。 (3)用siRNA技术沉默肝癌细胞株HepG2、BEL-7404中GCF2的表达,用实时荧光定量PCR与western blot方法初步检测沉默GCF2后,受其调控的13个与细胞迁移侵袭相关候选靶基因(课题组前期研究筛出)的表达变化情况。 (4)构建靶基因启动子荧光素酶报告基因质粒,通过双荧光素酶报告系统检测GCF2对候选靶基因启动子活性的影响,进一步确定GCF2对肝癌迁移侵袭相关靶基因的调控。 结果: (1)沉默GCF2后显著降低了肝癌细胞株HepG2、BEL-7404、MHCC97-H的迁移侵袭能力。在3种肝癌细胞株中,干扰组(siRNA-GCF2)穿过8μm微孔滤膜的细胞数目均明显少于对照组(siRNA-NC)穿膜细胞数,经独立样本t检验,差异具有统计学意义(P<0.01)。 (2)根据裸鼠人肝癌模型各组转移瘤病理改变情况发现:干扰组(LV5-GCF2)与对照组(野生型细胞组、LV3-NC非特异干扰组)相比,沉默GCF2后可以抑制肝癌细胞株BEL-7404的肝内转移(P<0.01);沉默GCF2表达对肝癌胃转移、肝癌胰腺转移、肝癌肺转移均没有显著性的抑制作用(P>0.05)。 (3)实时荧光定量PCR与western blot结果显示沉默GCF2表达后,Galectin-1在HepG2、BEL-7404中的表达均升高,而MyD88在HepG2中的表达下降,在BEL-7404中的表达升高。双荧光素酶报告系统检测确认GCF2对细胞迁移侵袭相关基因Galectin-1启动子具有负向调节作用。 结论: 本研究证实GCF2促进肝癌细胞迁移侵袭;初步发现沉默肝癌细胞株BEL-7404内GCF2表达后可以抑制其在肝内转移,但对肝外转移无显著性抑制作用;GCF2对下游细胞迁移侵袭相关靶基因Galectin-1、MyD88表达有不同的调节作用,GCF2可通过抑制Galectin-1转录活性而调控肝癌细胞的迁移侵袭能力,而GCF2调控MyD88影响肝癌细胞迁移侵袭的具体机制有待进一步探讨。