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背景:种类繁多的微生物在根管内壁及根尖周组织以生物膜的形式定植,是促进慢性根尖周炎持续进展的关键因素。感染根管微生物群落中细菌多样性及丰度的研究,对根管内的感染控制、提高患牙根管治疗的成功率和患者的生活质量有重要意义。此外,口腔细菌生物膜复杂的三维结构是菌体耐药和免疫逃逸的基础,是根尖周炎反复发作、难以治愈的主要原因之一。目前关于感染根管生物膜模型较多,但还没有一个标准的模型。本项目基于感染根管内生物膜多样性的研究,构建感染根管生物膜模型,在此模型基础上一方面研究优势菌间的相互作用,另一方面为细菌生物膜控制药物的研究和评价提供有效的工具。目的:（1）研究初次感染根管内微生物群落的细菌种类和丰度,为感染根管标准生物膜模型的构建提供理论基础。（2）基于微生物群落测序结果初步构建感染根管生物膜模型,为优势菌间相互作用的研究和根管冲洗液效果的评价提供一个有效的工具。（3）采用上述构建的生物膜模型评价前期研究中筛选出的对抑制牙菌斑生物膜有效的两种小分子抗菌肽buCa THL4B和Im-4抑制生物膜的作用效果及机制研究,为小分子抗菌肽控制根管内感染的临床应用提供实验室依据。方法:（1）收集原发性根尖周炎病例,采集根管内感染物质,进行16S rDNA测序,应用生物信息学方法分析样品中细菌多样性和丰度,并预测物种潜在的生物学功能。（2）基于16S rDNA测序结果,在模拟口腔环境条件下按照一定比例混合培养,形成两菌种生物膜,构建体外感染根管生物膜模型,并进行生物膜特征检测,以及模型中两菌种生长情况的描述。（3）采用上述方法构建的生物膜模型,通过激光共聚焦显微镜,检测两种不同来源的抗菌肽单独使用及联合氯己定抑制生物膜形成的作用效果。结果:（1）符合标准纳入数据分析的样品共有的13份,共检出359个菌种,可分为40个门,主要分布于拟杆菌门（32.05%）、厚壁菌门（31.23%）和变形菌门（12.49%）。检出率排名前五的菌种分别为具核梭杆菌（100%,丰度为5.76%）、植物乳杆菌（100%,丰度为1.12%）、沃尔巴克氏体共生（100%,丰度为1.00%）、皮氏罗尔斯顿菌（100%,丰度为0.23%）、产酸克雷伯菌（100%,丰度为0.22%）。检出丰度排名前五的的菌种为牙龈卟啉单胞菌（丰度为7.02%,检出率53.85%）、具核梭杆菌（丰度为5.76%,检出率100%）、戴阿李斯特菌（丰度为5.57%,检出率84.62%）、鱼腥味锥形杆菌（丰度为5.31%,检出率61.54%）、牙髓卟啉单胞菌（丰度为3.66%,检出率84.62%）。多样性分析结果显示,不同样本之间存在显著的个体差异。潜在生物学功能预测结果显示,感染根管中物种在新陈代谢、环境信息处理、遗传信息处理以及生物学过程等显著富集。（2）基于16S rDNA测序结果,结合各物种的检出率和丰度值,具核梭杆菌的检出率乘以丰度值最高。基于文献学习,在根管生物膜模型研究中采用最多的菌种是粪肠球菌（在本研究16S rDNA测序中粪肠球菌检出率83.33%,丰度1.19%）,故选择具核梭杆菌和粪肠球菌共同构建两菌种生物膜。将两菌种1:1（菌落数分别为1.5×106 CFU/m L）等体积混合,接种于羟基磷灰石圆片,构建两菌种感染根管体外细菌生物膜模型。通过激光共聚焦扫描三维重建后对生物膜的生长情况及死菌率进行计算。24 h到48 h生物膜体积显著增长,48 h后生物膜体积增长趋于平缓。死菌率均低于10%,控制在良好水平。通过real-time PCR对生物膜中具核梭杆菌和粪肠球菌的菌落数进行计算。随着时间的增长,生物膜中的具核梭杆菌和粪肠球菌的细菌数量明显增加。24 h生物膜中具核梭杆菌的数量多于粪肠球菌（P=0.02）,48 h生物膜中二者之间无显著统计学差异（P=0.169）,72 h生物膜中具核梭杆菌数量显著多于粪肠球菌（P＜0.01）。（3）采用上述构建的两菌种生物膜模型检测buCa THL4B和Im-4抑制生物膜的作用效果,杀菌率分别为（46.25±3.58）%、（48.30±2.80）%。buCa THL4B和Im-4与氯己定联合使用时杀菌率分别为（58.98±6.64）%、（65.39±4.70）%,杀菌效果均优于单独使用（P＜0.001）。抑制生物膜形成检测结果显示,buCa THL4B组在24h、48 h、72 h总生物膜体积分别为（9.60±3.11）×106μm3、（2.28±0.30）×107μm3、（3.52±0.98）×107μm3,Im-4组在24 h、48 h、72 h总生物膜体积分别为（4.93±2.65）×106μm3、（1.37±0.55）×107μm3、（2.19±0.32）×107μm3,均低于空白组生物膜体积,分别为（2.99±0.27）×107μm3、（4.47±0.23）×107μm3、（4.62±0.28）×107μm3,差异有显著性（P＜0.001）。Im-4抑制生物膜效果优于buCa THL4B组,差异有显著性（P＜0.01）。buCa THL4B组在24 h、48 h、72 h的杀菌率分别为（54.06±13.53）%、（62.97±2.77）%、（54.18±4.29）%,Im-4组在24 h、48 h、72 h的杀菌率（33.60±8.16）%、（37.89±8.04）%、（36.68±4.16）%,均显著高于空白组杀菌率,分别为（7.50±4.79）%、（6.56±2.20）%、（5.19±3.27）%,差异有显著性（P＜0.01）。buCa THL4B组杀菌效果优于Im-4组,差异有显著性（P＜0.001）。结论:根尖周炎初次感染根管具有丰富的细菌组成,其中具核梭杆菌的检出率最高,丰度值也较高,说明其在细菌生物膜形成的过程中起重要作用。结合根管生物膜模型研究中采用最多的粪肠球菌,成功构建了一个两菌种生物膜模型,该模型能够有效地评价buCa THL4B和Im-4抑制感染根管内生物膜的作用效果,为小分子抗菌肽的临床应用提供实验室依据。后期将在此基础上构建三菌种、四菌种或五菌种生物膜,进一步研究细菌间的相互作用及作用机制,评价各种根管冲洗药物的作用效果。