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糖基化是真核生物中广泛存在的一种蛋白翻译后修饰类型,随着对其生物学功能的深入研究,发现糖链结构对于糖蛋白的功能具有重要作用。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastris)作为单细胞真核生物,具有简单的翻译后修饰系统,能对其表达的蛋白进行糖基化和O-糖基化修饰。P.pastoriis的N-糖基化糖链类型为高甘露糖(Mannose)型,多糖大小相对均一,平均含有8-14个甘露糖残基。P.pastoris O-糖基化完全由O-甘露糖组成,由4-5个α-连接的甘露糖残基组成线性结构,可被β-或磷酸甘露糖进一步封端。随着Ppastors表达系统的日益成熟,使用P.pastoris表达糖蛋白已成为研究热点。本文第一部分通过表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)糖蛋白并分析其O-Man糖基化水平,比较P.pastoris和结核分支杆菌的O-Man糖基转移酶的底物特异性。第二部分我们通过在P.pastoris的内质网、高尔基体或细胞表面定位表达ENGase,构建重组菌株生产具有N-GlcNAc修饰的糖蛋白,为P.pastoris表达的N-糖蛋白的进一步N-糖基化改造奠定了基础。O-Man糖基化是一种广泛存在于细菌、真菌和动物中的糖基化修饰形式,在以细胞相互作用为基础的病变中起着极为重要的作用,同时在病原菌的黏附侵袭、抗原性和保护性免疫等过程中发挥重要作用。M.tuberculosis中,富含Ala-Pro的抗原(Ala-Pro-rich antigen,Apa)是主要的免疫抗原,具有作为结核病疫苗和诊断试剂的潜力。目前研究表明Apa含有四个明确的糖基化位点(Thr10,Thr18,Thr27和Thr277),每个结构含1-3个α1,2连接的甘露糖单元。这四个位点的O-甘露糖基化修饰在M.tuberculosis在宿主细胞的定殖和侵入过程中具有至关重要的作用。在本论文中,我们将从M.tuberculosis基因组中克隆出来的Apa基因在P.pastoris GS1 15中表达。使用凝集素识别和MALDI-TOF的方法对重组Apa(rApa)蛋白的糖基化进行表征。结果表明:在P.pastoris表达体系中rApa被分泌到发酵液上清中,产率达到0.6g/L;Western Blot结果显示,rApa中存在N-糖基化修饰和O-糖基化修饰;通过对rApa O-糖基化位点进行分析发现,在巴斯德P.pastoris中表达的rApa,不仅M.tuberculosis来源的4个已知的O-甘露糖基化位点被修饰,还有一些其他的位点也被O-Man修饰。因此,P.pastoris可以识别M.tuberculosis Apa已知的糖基化位点。糖基化位点及糖链长度与天然存在的Apa类似。因此,P.pastoris在结核病疫苗和诊断上具有巨大潜力。另外,P.pastoris可以作为O-甘露糖基转移酶底物特异性研究的平台。生物体中的N-糖基化对于蛋白的构象,稳定性,药代动力学和抗原性是必需的,目前市场上生物治疗药物超过300种,包括单克隆抗体、激素和生长因子,大多数为N-连接糖蛋白。由于不同物种间N-糖基化类型存在差异,大多数重组表达系统生产的治疗糖蛋白携带非人源的N-聚糖结构,可能引起不必要的免疫应答,严重甚至导致过敏反应。β-乙酰内切葡萄糖苷酶(ENGase)是一类能作用于N-糖基化核心结构的两个GlcNAc残基的糖苷酶,产生只含一个GlcNAc残基的糖肽或糖蛋白。部分的GH85家族的ENGase还具有转糖基活性,可以将结构确定且均一的糖链转移至糖肽或糖蛋白的GlcNAc残基上。由于ENGase的广泛研究及其生物学作用,其在药用蛋白生产上可能具有巨大的潜在价值。本文将红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)来源的 ENGase(Endo-T)在 P.pastoris 高尔基体或内质网中进行定位表达,构建生产单个GlcNAc修饰的糖蛋白的重组P.pastoris菌株,并使用GalNAc-T1及IgG Fc片段作为报告蛋白进行表征。结果表明:Endo-T在P.pastoris中的不同定位均能发挥其糖苷酶作用,其中Endo-T定位于高尔基体酶切效率更好,可能是由于Endo-T的最适pH值与高尔基体内环境pH值更为接近。改造后的糖工程菌株对治疗用N-糖蛋白的生产具有潜在的应用价值。