目前有机磷农药已成为人们用于提高农作物产量和日常生活杀虫的必需品。与其它种类农药相比,有机磷杀虫剂(Organophosphorus pesticides,OPs)具有价格低廉、杀虫谱广、残效期短及抗药性不显著等优点,成为目前应用最多的杀虫剂之一。也是目前我国使用范围最广、用量最大的农药,被广泛用于家庭和农业防虫抗害。OPs在全球范围内的大量使用,对环境造成持续性污染。这种长期、低剂量的OPs暴露对人类健康产生的威胁值得关注。流行病学研究显示,长期接触低剂量OPs会影响生殖功能。研究表明,农药污染严重地区男性生育能力低下问题尤为突出。主要表现为影响精子质量(对精子密度、精子存活率、快速前向运动率及精子正常形态率均有负面作用)、降低精子受精能力、产生不良生殖结局。长期低剂量接触OPs工人的精液染色质结构发生了改变,82%接触有机磷农药的工人不成熟精子的指标高于正常值,但具体作用机制还不清楚。毒死蜱(Chlorpyrifos,CPF)是一种广谱、高效、低毒的OPs,由于其严重的发育毒性,2002年美国已禁止将CPF应用于家庭杀虫,但目前CPF仍然大量应用于农作物的杀虫,是全球使用量最多的OPs之一。CPF是2007年以后我国推荐的禁用高毒Ops(对硫磷、甲胺磷等)的替代品之一,是我国目前应用最为广泛的5种杀虫剂之一,也是我国农副产品中经常检测出的主要残留农药和超标农药。CPF在环境中极易造成水体、大气、土壤以及动植物的污染,甚至有可能通过生物富积而对人类健康构成严重威胁,CPF对人类潜在毒性的争论引起了极大的关注。据报道CPF可介导啮齿类动物出现生殖毒性,通过降低血清睾酮水平,减低附睾及睾丸中精子数量,损伤生精细胞及介导曲细精管变形。可诱导人体睾丸毒性,影响精子质量及生殖激素,导致内分泌紊乱。而对于长期低剂量CPF暴露对雄性生殖毒性影响的研究并不多见,对于CPF如何诱导雄性大鼠生殖功能障碍的作用机制还不清楚。因此,研究CPF长期低剂量重复暴露对雄性大鼠的生殖毒性及其可能作用机制具有重要意义。本课题选择不引起动物出现全身中毒症状的低剂量,对大鼠施以16周(W)的持续染毒,探讨CPF重复染毒对雄性生殖毒性的影响及其可能作用机制。为有机磷农药中毒的临床解救提供参考,为农药健康风险评估提供理论依据。本课题研究内容分为两部分。第一部分主要研究CPF重复染毒对雄性大鼠生殖功能的影响。选用CPF为受试物,选择不引起动物出现有机磷全身中毒症状的低剂量CPF(1、5、10mg/kg三个染毒组和一个溶剂对照组),对雄性Wistar大鼠给予连续16W灌胃染毒,每日灌胃染毒1次。染毒结束后对雄性大鼠相关生殖功能指标进行检测。取附睾和睾丸称量湿重计算脏器系数,对睾丸进行组织病理学检查,取附睾尾精子进行精子数量、活力及畸形率的检查,检测睾丸碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性,探讨CPF重复染毒对雄性大鼠的生殖功能的影响。第二部分主要研究CPF低剂量下重复染毒诱导大鼠生殖毒性的可能作用机制。采用TUNEL法测定睾丸组织的凋亡情况,免疫组化和免疫蛋白印迹方法检测睾丸组织细胞凋亡情况及相关凋亡信号通路关键调控蛋白的表达,调节激素生成的相关受体表达及雄激素生成过程中合成调节蛋白和关键酶的变化,探讨CPF诱发雄性大鼠生殖毒性的可能作用机制。结果发现,经过16W CPF连续染毒,动物体重、日摄食量均没有明显改变,试验过程中也未观察到流涎、肌肉震颤、腹泻等有机磷中毒症状。组织病理学检查雄性大鼠睾丸,发现染毒动物各级生精细胞数较少、细胞变性、脱落至管腔,间质水肿、增宽;BrdU检测显示染毒动物睾丸曲细精管中具有增殖能力的生精细胞数目明显减少;CPF能显著降低精子数、精子活动率,导致精子畸形率升高,提示精子生成出现障碍。CPF能升高血清中黄体生成素(Luteinizing hormone,LH)水平,降低睾酮(Testosterone,T)含量,影响睾丸中正常激素调节,睾丸中标志酶LDH、ACP、AKP和γ-GT的活力显著降低。以上结果说明CPF能够诱发雄性大鼠的生殖毒性,主要表现为生精障碍。CPF染毒后,TUNEL分析显示染毒动物睾丸生精细胞凋亡增加,与对照组相比凋亡调控蛋白BAX、Bcl-2(BAX/Bcl-2),FAS、FASL和Caspase-3表达均显著升高,说明CPF染毒能够诱发生殖细胞的凋亡,影响生精过程的正常动态平衡,这可能是CPF诱发雄性大鼠生殖毒性的作用机制之一。血清中LH含量升高和T含量降低,进一步的研究发现大鼠睾丸组织中相关雄激素受体(AR),黄体生成素(LHR)和卵泡刺激素受体(FSHR)的表达明显降低,同时合成雄激素的过程中相关调节蛋白及关键酶的表达也明显降低。可见CPF可能通过调节T合成的相关蛋白及关键酶的表达而调节睾丸中激素水平,从而影响生精过程,诱发雄性大鼠生殖毒性。综上所述,CPF低剂量重复染毒能够诱发雄性大鼠的生殖毒性,主要表现为染毒大鼠睾丸组织出生精细胞减少,睾丸标志酶降低,精子数目减少、活率降低及畸形率升高。其机制可能与激活细胞中死亡受体及线粒体途径而引起睾丸生精细胞凋亡,导致生精细胞减少,并通过调节T合成相关蛋白及关键酶的表达而调节睾丸中激素水平,从而影响生精过程,产生生殖毒性。