血吸虫病(Schistosomiasis)是由血吸虫(Schistosome)感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。全球有74个国家和地区流行血吸虫病,有5-6亿人受到威胁,约2亿人感染血吸虫病。当前血吸虫的防治策略主要以化疗药吡喹酮来进行治疗,从而减少发病率。但是吡喹酮又不能避免重复感染,而且近年来曼氏血吸虫已经有吡喹酮抗性虫株的报道,耐药虫株的出现引起了人们的不安与高度关注。因此,加强抗血吸虫疫苗的开发和新药物靶标的筛选显得格外重要。在我国,日本血吸虫(Schistosoma japonicum)可以感染40多种哺乳动物,山羊、黄牛、绵羊、兔子和小鼠等都是其易感宿主,但是另外一些哺乳动物如大鼠等是日本血吸虫的不易感宿主。在不易感宿主体内,血吸虫的发育率低而且虫体较小。东方田鼠是目前为止唯一一种对日本血吸虫具有抗性的宿主,日本血吸虫尾蚴可以感染东方田鼠,感染之后虫体发育迟缓,在感染尾蚴15天后,东方田鼠体内基本上找不到存活的虫体,感染42天后,东方田鼠体内检查不到日本血吸虫成虫。不同的宿主能够为日本血吸虫提供不同的生存环境,影响到虫体的生存和发育。不同宿主环境中生长的虫体在蛋白表达上也会存在差异,而这些差异表达的蛋白可能是虫体生存发育所需要的关键分子。因此找到在不同易感性宿主环境中日本血吸虫生长发育差异的蛋白具有重要理论和实际意义。1、日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究本文应用荧光差异凝胶双向电泳技术(2D-DIGE),对BALB/c小鼠、Wistar大鼠和东方田鼠体内的10d日本血吸虫童虫的蛋白表达情况进行了分析,通过DeCyder 6.5软件分析和匹配后,得到了1721个点适合进行后续的差异分析。在大鼠体内10d童虫蛋白和小鼠体内10d童虫蛋白的比较分析中发现,有39个蛋白点存在显著性差异,其中有27个蛋白点在小鼠体内1Od童虫中高表达,12个蛋白点低表达。在小鼠体内lOd童虫蛋白和东方田鼠体内10d童虫蛋白的比较分析中发现,有21个蛋白点存在显著性差异,其中有13个蛋白点在小鼠体内10d童虫中高表达,8个蛋白点低表达。将分析胶与制备胶进行比对挑点,最终共有44个差异表达蛋白能够进行后续的质谱分析。将质谱鉴定出的数据进行搜库比对,其中3个蛋白点没有注释信息,其余41个蛋白点经过序列比对与去重复分析后发现,共代表了33种蛋白。为了验证2D-DIGE实验分析的可靠性,我们挑取了其中6个差异表达蛋白进行了实时定量分析,在基因水平上对其结果进行验证,验证结果显示,实时定量的结果与2D-DIGE的结果基本一致。我们对差异表达蛋白进行了GO分类以及KEGG通路分析,结果显示,在小鼠体内10d童虫和大鼠体内10d童虫的差异表达蛋白中,40%的差异蛋白在蛋白代谢途径中,26%的差异蛋白在糖类代谢途径中,13%的差异蛋白在RNA代谢途径中,9%的差异蛋白与应激反应有关,其余的差异表达蛋白与蛋白转运、调节基因表达和细胞骨架蛋白有关。在小鼠体内10d童虫和东方田鼠体内10d童虫的差异表达蛋白中,53%的差异蛋白在蛋白代谢途径中,23%的差异蛋白在RNA代谢途径中,其余的差异表达蛋白与糖类代谢途径、核酸代谢途径和细胞骨架蛋白有关。其中线粒体外膜转移酶复合物TOM34、蛋白酶体亚基、核内核糖体异构蛋白K和肌动蛋白在易感宿主小鼠体内高表达,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂、醛缩酶和70kDa热激蛋白在不易感宿主大鼠体内或抗性宿主东方田鼠体内高表达。本文首次对不同宿主体内的日本血吸虫10d童虫进行了蛋白质组分析,为我们更好的理解血吸虫的生长发育机制提供了依据,同时也可为抗血吸虫疫苗和潜在药物靶标的研究提供基础。2、日本血吸虫蛋白酶体α5和α2亚基基因的克隆、表达及免疫效果观察本文利用RT-PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体a5亚基基因(GenBank accession FJ595238)。序列分析表明蛋白酶体α5亚基基因的ORF含747bp,编码248个氨基酸,理论分子量27.38 kDa。同源性分析结果显示,该基因分别为日本血吸虫蛋白酶体α5亚基,命名为SjPSMA5。实时定量PCR对该基因在虫体不同发育阶段和不同宿主体内10d童虫中的表达情况进行了分析,结果显示,该基因在7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d虫体中都有表达,13d和32d虫体中的表达量高于其他时期；在小鼠体内的10d童虫中的表达量要高于大鼠和东方田鼠体内的10d童虫中的表达量。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA5,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白rSjPSMA5以包涵体形式存在。Western印迹显示表达的重组蛋白rSjPSMA5能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。免疫组化实验结果表明,SjPSMA5蛋白在虫体各组织器官内广泛分布。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,产生了较高的特异性抗体水平,并且CD4+细胞数量显著升高,诱导了23.29%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率本文利用RT-PCR技术从日本血吸虫18d童虫中扩增到蛋白酶体α2亚基基因(GenBank accession AY813725)。序列分析表明蛋白酶体α2亚基基因的ORF含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84 kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR对该基因在虫体不同发育阶段和不同宿主体内10d童虫中的表达情况进行了分析,结果显示,该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期；在小鼠体内的10d童虫中的表达量要略高于大鼠和东方田鼠体内的10d童虫中的表达量。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白rSjPSMA2以包涵体形式存在。Western印迹显示表达的重组蛋白rSjPSMA2能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。免疫组化实验结果表明,SjPSMA2蛋白在虫体各组织器官内广泛分布。应用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,产生了较高的特异性抗体水平,诱导了12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。综上所述,SjPSMA5和SjPSMA2都可作为潜在的抗血吸虫病的疫苗候选分子,SjPSMA5和SjPSMA2基因及表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。3、日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶的特性研究根据GenBank上公布的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶(thioredoxin peroxidase, TPx)基因的登陆号AY813893,对其序列进行分析,结果表明,该基因的ORF含681bp,编码227个氨基酸,理论分子量25.09 kDa。信号肽预测显示,该基因的前24个氨基酸为信号肽序列。设计去除信号肽序列的引物,利用RT-PCR技术从日本血吸虫42 d童虫中扩增到约600bp的产物。测序结果表明,扩增片断为日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶去除信号肽后的ORF序列。实时定量PCR对该基因在虫体不同发育阶段和不同宿主体内10d童虫中的表达情况进行了分析,结果显示,该基因在虫卵、尾蚴、7d、13d、21d、28d、35d和42d虫体中都有表达,7d、13d和42 d雌虫中表达量高于其他几个时期；在大鼠体内的10d童虫中的表达量要高于小鼠和东方田鼠体内的10d童虫中的表达量。构建了该基因的原核表达质粒pET28a(+)-SjTPx,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。免疫组化实验结果表明,SjTPx蛋白主要分布于虫体皮下实质组织,体内其他部分也有分布。质谱鉴定的结果说明,纯化的重组SjTPx蛋白在体外可以以二聚体形式存在。酶活实验的结果说明,SjTPx在体外具有过氧化物酶活性。SjTPx基因及其表达产物的获得,为探索硫氧还蛋白过氧化物酶在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。