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目的:斑点状的POZ结构域蛋白(SPOP)作为E3泛素连接酶的底物识别器,在许多癌症起着重要作用。前期实验数据表明SPOP在绒毛膜癌中发挥着抑癌的作用,但SPOP调控绒毛癌膜的具体机制仍未明确,本文旨在寻找绒毛膜癌中SPOP泛素化底物及SPOP与泛素化底物调控绒癌的机制。方法:(1)首先将已构建的过表达SPOP和干扰SPOP的慢病毒载体转染到绒毛膜癌JAR细胞中,采用q RT-PCR和Western blot实验验证其效率。结合label-free泛素化修饰定量蛋白质组学结果、SBC基序、前期SPOP研究结果及绒癌高度侵袭性的特点,筛选相关蛋白。(2)采用Western blot实验检测绒毛外滋养层细胞HTR-8/Svneo、绒毛膜癌JAR细胞和JEG3细胞中KIF23的表达情况,免疫荧光实验检测KIF23的定位。(3)免疫共沉淀法和Western blot实验检测SPOP与驱动蛋白家族成员23(KIF23)间的相关性。(4)使用小干扰RNA基因沉默KIF23,采用q RT-PCR和Western blot实验筛选出干扰效率最佳的KIF23-si RNA。采用CCK8法、平板克隆形成实验和Western Blot实验及Transwell侵袭迁移实验探究KIF23对JAR细胞增殖、侵袭和迁移能力影响以及Akt/GSK3β信号通路中蛋白Akt、GSK3β的磷酸化水平变化情况。(5)随后将label-free泛素化修饰定量蛋白质组学分析结果、免疫共沉淀实验联合质谱结果和SBC基序相结合筛选相关蛋白。(6)在HTR-8/Svneo细胞、JAR细胞和JEG3细胞中通过Western blot实验检测核DNA解旋酶Ⅱ和RNA解旋酶A(DHX9)的表达,免疫荧光实验检测其定位。(7)通过免疫共沉淀实验检测JAR细胞和JEG3细胞中SPOP与DHX9的内源性作用;在JAR细胞中分别构建过表达Flag-SPOP或HADHX9细胞模型;293T细胞中构建共表达Flag-SPOP及HA-DHX9细胞模型;293T细胞中构建共表达Flag-SPOP及HA-DHX9-△SBC细胞模型,均采用免疫共沉淀实验探究两者之间的相互作用关系;(8)后续采用q RT-PCR、Western blot实验和内源性泛素化实验用于观察SPOP对DHX9降解和泛素化的影响。(9)构建DHX9基因沉默的JAR细胞模型,并采用q RT-PCR、Western blot实验验证其干扰效率。采用q RT-PCR、Western blot实验和侵袭迁移实验观察SPOP与DHX9间的相关性对JAR细胞侵袭迁移能力及EMT相关蛋白(N-Cadherin,vimentin,E-Cadherin,cytokeratin 8)表达的影响。结果:(1)构建过表达和敲低SPOP的JAR细胞模型,并从m RNA水平和蛋白水平验证了模型构建成功。结合相关实验结果,筛选出驱动蛋白KIF23(Treat/Control>1.50)。(2)与HTR-8/Svneo细胞相比,KIF23在JAR细胞、JEG3细胞中呈现高表达,并且KIF23主要集中在3种细胞的胞核。(3)相比于对照组,过表达SPOP中KIF23蛋白表达下降,敲低SPOP中KIF23表达升高,加入MG132后被SPOP降解的KIF23表达增多。Flag-SPOP通过免疫共沉淀沉淀KIF23,免疫印迹法中无KIF23对应条带。(4)KIF23-si RNA1在m RNA水平和蛋白水平都可有效沉默JAR细胞中的KIF23。与NC-si RNA组比,KIF23-si RNA组能明显抑制JAR细胞的增殖能力和侵袭迁移能力;KIF23-si RNA组中总的Akt和总的GSK3β蛋白水平不变,p-Akt/Akt和p-GSK3β/GSK3β显著降低。(5)结合相关实验结果,进一步筛选出DHX9蛋白。(6)与HTR-8/Svneo细胞相比,DHX9在JAR细胞、JEG3细胞中呈高表达;与SPOP的定位相同,DHX9主要定位于HTR-8/Svneo细胞、JAR细胞和JEG3细胞的胞核中。(7)DHX9在绒癌JAR细胞和JEG3细胞中都能共沉淀出SPOP;无论是在293T细胞还是JAR细胞中,Flag-SPOP/HA-DHX9均可通过抗体将DHX9/SPOP作用下来,并能在Western blot实验检测出对应条带;但在共表达Flag-SPOP和HA-DHX9-△SBC的293T细胞中,FlagSPOP不能将HA-DHX9-△SBC作用下来,Western blot实验中并无DHX9对应蛋白条带。(8)在过表达SPOP的JAR细胞中DHX9表达明显降低,在沉默SPOP的JAR细胞中DHX9表达明显升高,并且2种细胞模型中DHX9m RNA改变无统计学意义;过表达SPOP的JAR中加入MG132后,DHX9的表达明显升高,而且细胞内泛素化实验呈阳性。(9)构建DHX9基因沉默的JAR细胞模型,并且在m RNA和蛋白水平验证了其干扰效率。与sh-NC组相比,sh-DHX9组明显抑制了JAR细胞的侵袭迁移能力,并且N-Cadherin和vimentin表达明显降低而E-Cadherin和cytokeratin 8表达无统计学差异;与sh-SPOP组相比,sh-SPOP+sh-DHX9组明显抑制了JAR细胞的侵袭迁移能力,NCadherin和vimentin表达明显降低,而E-Cadherin和cytokeratin 8表达无统计学差异。结论:(1)KIF23与SPOP无相互作用,但是SPOP可促进KIF23的降解,KIF23可能通过激活Akt/GSK3β通路促进JAR细胞的增殖、侵袭和迁移。(2)SPOP通过促进DHX9的泛素化和降解进而减弱JAR细胞迁移和侵袭能力。