作为重要的表观遗传标记,DNA甲基化涉及生物体内的多种分子机制,参与植物的基因印记、生长发育、胁迫应答、次生代谢等生物学过程。由于DNA甲基化研究在模式植物和作物中取得的重要进展,科研人员逐渐意识到药用植物品质的形成必然也受到DNA甲基化的调控,然而DNA甲基化在其中所扮演的具体作用和调控的分子机制还不清楚。丹参具有药用活性成分清楚、世代周期短、组织培养简单、遗传转化体系成熟等优点,是药用植物遗传学和表观遗传学研究的理想材料。本研究分析了 3月份和7月份两个时期的丹参根以及7月份的根和叶中的DNA甲基化差异,结合DNA甲基转移酶家族基因和去甲基化酶家族基因的系统分析,探讨DNA甲基化在丹参中的生物学功能,为深入理解DNA甲基化在丹参生长发育、次生代谢、胁迫响应等生物学过程中的作用奠定基础,进而为丹参等药用植物的栽培、分子育种提供理论指导。获得了以下主要结果:1.利用亚硫酸盐测序的方法对丹参3月份的根以及7月份的根和叶进行了单碱基分辨率甲基组解析,研究表明组织间甲基化的差异主要出现在基因的启动子区和重复序列区。甲基化胞嘧啶主要来自于CHH背景,鉴定到的差异甲基化位点(DMS)和差异甲基化区(DMR)大部分也属于CHH序列背景。对两个根组织比较分析,发现443245、315015和1879317个分别属于CG、CHG和CHH序列背景的DMS,12539、10879和18336个分别属于CG、CHG和CHH序列背景的DMR。对7月份根与叶比较分析,发现293994、394298和3093880个分别属于CG、CHG和CHH序列背景的DMS,13072、13018和34873个分别属于CG,CHG和CHH序列背景的 DMR。2.对两个时期根之间的DMR相关基因进行KEGG富集分析发现所有背景的DMR相关基因都富集于二萜生物合成通路上,CG和CHH背景发生了显著富集。通过DNA甲基化抑制剂5Aza-dC处理生长两个月的丹参毛状根,可显著提高丹参酮类物质的生物合成,表明DNA甲基化参与了丹参酮的生物合成。3.DNA甲基转移酶基因(C5-MTase)参与了 DNA甲基化的建立和维持。从丹参基因组中鉴定了 8个C5-MTase基因,进化树和保守结构域分析表明SmC5-MTases由4个亚家族组成,包括SmMET、SCMT、SmDRM和SmDNMT2。对丹参和拟南芥C5-MTase基因的比较分析,发现SmC5-MTases具有保守性和多样性。SmC5-MTase可响应酵母提取物、茉莉酸甲酯和水杨酸的处理,暗示SmC5-MTases在丹参次生代谢和胁迫响应中发挥重要作用。4.DNA去甲基化酶(DML)通过碱基切除修复依赖的DNA去甲基化来调控生物学过程。从丹参中鉴定出6个SmDML基因。基因结构、序列特征、保守结构域和基序、进化和差异表达的系统分析,发现SmDML具有保守性和多样性。DNA甲基化抑制剂5Aza-dC处理显著下调SmDML1、SmDML2和SmDML4的表达,表明SmDML参与基因组DNA甲基化的调控。转录后调控分析表明,SmDML1受到Smi-miR7972的剪切。进一步研究发现MIR7972只存在唇形亚纲的唇形目、茄目和紫草目的一些物种中,在物种进化过程中发生了复制和丢失。5.构建了Sm ET1和SmDML3的CRISPR/Cas9的双靶点载体,共获得8个SmMET1和4个SmDML3的突变株系,为SmMET1和SmDML3的功能分析提供了平台,也表明这一新兴的基因组编辑技术在药用植物基因功能研究和品质改良方面具有巨大的潜力。