蛋白质作为承载生物功能的重要载体,在生命活动中发挥着极其关键的作用。蛋白质组学的研究发现并揭示了很多重要蛋白的生理功能与调控机制,极大地促进了我们对生命活动机制的理解。目前大多数关于蛋白质的研究是基于传统的生化方法,这些方法主要在溶液体系中进行,溶液体系简单可控,给研究带来了种种便利。然而,细胞作为组成生命体的最小单元,其复杂性远超出了人们的想象,因此在溶液中得到的研究结果不一定能够真实地反映蛋白在细胞内的存在状态。此外,绝大多数细胞外溶液体系的研究结果是建立在对细胞群体研究的基础上,忽略了细胞个体间的异质性(Cellular Heterogeneity)。这必然会导致生物信息的稀释或丢失,甚至会得出矛盾的结论。荧光相关光谱(FCS)及其相关技术是近年来发展的单分子检测方法,其具有灵敏度高,空间分辨率高,非侵入性检测等优点。这使得FCS及其相关技术非常适合在活细胞内进行蛋白浓度、扩散行为、寡聚化和相互作用等研究。同时荧光相关光谱适合在单个活细胞水平甚至是在亚细胞结构水平进行测定。本论文以荧光蛋白作为探针标记目标蛋白分子,同时构建了能够实现在线细胞培养、高分辨率成像以及活细胞原位荧光相关光谱测定的检测系统。在此基础上,我们在活细胞内直接测定了与癌症密切相关的PTEN蛋白的动力学信息,以及p53蛋白与MDM2蛋白间的相互作用,分别从蛋白结构和外界刺激两个方面研究了单个活细胞内蛋白的功能与调控机制。研究工作主要包括:1.PTEN是最重要的肿瘤抑制蛋白之一,其在PI3K/AKT通路中起着关键的负调控作用。PTEN蛋白能够调控一系列关于细胞生长、增殖和迁移的生命活动。尽管人们对PTEN蛋白已经有了比较深入的了解,但是并不清楚其在单个活细胞内的动力学行为。我们构建了能够稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记的PTEN蛋白的单克隆细胞株。利用FCS测定,我们在单个活细胞内原位研究了细胞在分别受到氧化压力和ATP损耗刺激后,细胞核与细胞质中PTEN蛋白的动力学行为。在氧化压力刺激后,细胞核内PTEN蛋白的浓度显著增加,细胞质内略有下降。同时,PTEN蛋白在细胞核与细胞质中的扩散系数D和异常扩散系数α都显著下降。在ATP损耗刺激后,细胞核内PTEN蛋白的浓度没有显著变化,细胞质内则显著下降。同时,PTEN蛋白在细胞质中的扩散系数D显著下降,细胞核中没有显著变化,细胞质与细胞核内的异常扩散系数α都显著下降。这些结果表明活细胞内的PTEN蛋白的浓度与扩散运动能够被外界刺激所调控,并且在细胞核与细胞质中具有不同的调控作用,这反映了PTEN蛋白在细胞核与细胞质中的功能与调控的差异性。2.p53蛋白是最重要的肿瘤抑制蛋白之一,在细胞凋亡、细胞周期抑制、细胞衰老和DNA损伤修复等生理过程中发挥着重要作用。MDM2是p53最重要的抑制蛋白,p53-MDM2的相互作用对于p53蛋白的调控具有重要意义,因此得到了比较深入的研究。尽管如此,受限于传统的生物学研究方法,活细胞内p53蛋白的不同结构对p53-MDM2相互作用的影响并不清楚。我们开发了能够在活细胞内直接监测p53-MDM2相互作用的荧光互相关光谱(FCCS)系统。通过基因融合的方式,我们分别将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(mCherry)融合标记在p53蛋白和MDM2蛋白的C端。通过慢病毒感染的方式,我们成功地构建了能够稳定表达p53-EGFP和MDM2-mCherry两种融合蛋白的细胞株,首次利用FCCS技术成功地监测到活细胞内p53-MDM2的相互作用。通过构建一系列具有不同结构的p53蛋白突变体,系统地研究了p53蛋白的同源寡聚化、N端瞬时螺旋性以及DNA结合结构域的热点突变分别对p53-MDM2结合的影响,在活细胞内分别从蛋白的一级、二级和四级结构水平研究了蛋白结构对蛋白间相互作用的影响。研究发现:(1)p53单体不能与MDM2结合,p53二聚体和四聚体能够与MDM2结合,并且四聚体对MDM2的亲合性高于二聚体。这表明MDM2能够选择性的与p53四聚体结合,有效的调节p53的功能。(2)p53对MDM2的亲合性随p53转录激活结构域(TAD)螺旋性的增加而逐渐增强,在活细胞内直接证明了p53 TAD结构域的螺旋性决定了p53对MDM2的亲合性。(3)绝大多数p53 DNA结合区域的热点病理突变不能影响p53对MDM2的亲合性,但是突变体R175H会导致p53对MDM2的亲合性下降,这可能与该突变体会导致该区域结构的高度去折叠化有关。3.在具有野生型p53的肿瘤细胞中,MDM2通常表现为过表达。过表达的MDM2蛋白抑制了p53蛋白的抑癌功能。因此,开发p53-MDM2相互作用的抑制剂已经成为了抗肿瘤药物开发的重要目标。尽管目前已经发现了多种针对p53-MDM2相互作用的抑制剂,并且很多抑制剂在生化实验中取得了非常好的抑制效果,但是针对活细胞体系,它们中的大多数却没有表现出抑制效果或者抑制效果较差。这使得开发在活细胞内原位评价抑制剂抑制效果的方法变得十分必要。在上一章构建好的活细胞内p53-MDM2相互作用的FCCS检测系统的基础上,我们发展了活细胞内抑制剂活性的评价新方法。我们比较了Nutlin 3α、MI773和RITA三种已知抑制剂分别在活细胞内的抑制效果。研究结果显示Nutlin 3α和MI773能够显著地抑制p53-MDM2的相互作用,其中MI773的抑制效果更好,而RITA不具有抑制效果。目前有关RITA的抑制活性处于争议中,我们的研究结果进一步否定了RITA的抑制效应。同时为了能够更好地监测抑制剂在单个活细胞内的抑制动力学过程,我们将微流控芯片技术与FCCS技术联用,实现了对单个活细胞内抑制剂的抑制动力学过程的监测。综上所述,本文中我们建立了FCS/FCCS的活细胞检测系统与方法,分别从蛋白结构和外界刺激两方面系统的研究了单个活细胞内蛋白的功能与调控机制,结果主要包括:外界刺激下细胞核与细胞质中PTEN蛋白具有不同的动力学行为,揭示了细胞核与细胞质内PTEN蛋白不同的生理功能,以及氧化压力刺激和ATP损耗刺激分别对核质内PTEN蛋白的不同影响;在活细胞内直接证明了p53蛋白TAD螺旋性、同源寡聚化、DNA结合结构域热点突变分别对p53-MDM2相互作用的影响;利用微流控芯片技术发展了针对p53-MDM2相互作用的活细胞内抑制剂评价新方法。