【摘 要】
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目的:构建M-CSF、MCM7及MCM7功能结构域突变体原核表达载体,并于E Coli. BL21 DE3中进行蛋白表达,建立M-CSF和MCM7原核表达体系。 方法:使用PCR技术扩增M-CSF与MCM7全长及
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目的:构建M-CSF、MCM7及MCM7功能结构域突变体原核表达载体,并于E Coli. BL21 DE3中进行蛋白表达,建立M-CSF和MCM7原核表达体系。 方法:使用PCR技术扩增M-CSF与MCM7全长及MCM7功能结构域突变体活性区,并连接插入GST标记的原核表达质粒pGEX-4T-2,构建M-CSF和MCM7及MCM7功能结构域突变体原核表达载体 pGEX-4T-2/M-CSF、pGEX-4T-2/MCM7/DM1-331、pGEX-4T-2/MCM7/DM332-538、pGEX-4T-2/MCM7/DM538-719和pGEX-4T-2/MCM7/DM1-719。经琼脂糖凝胶电泳、PCR和测序鉴定后,用氯化钙法分别转化E Coli. BL21 DE3菌株,经氨苄青霉素筛选并扩增阳性克隆后,用IPTG诱导蛋白表达。 结果:琼脂糖凝胶电泳分析显示插入质粒的片段大小与M-CSF和MCM7及MCM7功能结构域突变体分子大小相当,DAN测序分析表明插入质粒的M-CSF和MCM7及其突变体无读码框移位和突变。IPTG诱导后,蛋白表达具有明显差异性,表达蛋白与预期表达蛋白质分子量大小相当。 结论: 1.成功构建M-CSF,全长MCM7及MCM7的三个功能结构域突变体原核表达载体。 2.成功在E Coli. BL21 DE3中表达M-CSF,全长MCM7及三个功能结构域突变体蛋白。
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