发现肝癌(Human hepatocellular carcinoma,HCC)相关基因的重要步骤之一是获得在肝癌组织中异常表达的基因。我们实验室运用cDNA芯片方法筛选到了一批在肝癌中异常表达的已知和未知基因。对这些基因的功能进行进一步研究将有助于对肝癌发病分子机理的深入了解。我们首先挑选了6个在芯片结果显示有差异表达的较有意义的基因,运用Northernblot方法做进一步验证。本课题对其中一个基因Dickkopfl(DKKl)与肝癌的相关性进行较深入的研究。　　 我们的结果发现在肝癌细胞株中分泌蛋白DKKl对Wnt/β-catenin信号通路具有抑制作用,这种抑制作用由于β-catenin基因的突变而丧失;而在肝癌细胞株中DKK1的表达水平和β-catenin定位相关,部分DKK1表达病例β-catenin存在突变,两套临床病例组化分析显示DKK1高表达与β-catenin胞浆/核累积具有相关性;在肝癌细胞中活化的Wnt信号可以反馈调节DKK1的表达。大样本量肝癌组织(来自314例外科切除和192例肝移植肝癌病人)免疫组化实验显示DKK1高表达肝癌病人,包括AFP阴性和TNMstageⅠ病人,存在较差的预后;DKK1和β-catenin双阳性病人存在更差的预后;并且多因素分析显示DKK1是肝癌病人总体生存和无瘤生存的独立预后指标。我们的分析显示DKK1基因在侵袭性肝癌细胞株和发生复发的肝癌病人中高表达;体外运动侵袭等相关实验和裸鼠体内实验显示干扰DKK1表达后显著抑制肝癌细胞侵袭转移的发生;我们进一步探讨了DKK1促进肝癌细胞侵袭转移过程的具体信号途径和分子机制。上述结果提示在肝癌中DKK1存在高表达并与Wnt信号的活化相关,同时DKK1可以作为肝癌病人的预后指标。　　 第一部分　　 DKK1在肝癌细胞Wnt通路中的作用　　 [目的]探讨DKK1在Wnt信号途径中的抑制作用是否由于β-catenin基因的突变而丧失和是否由于β-catenin基因的突变引起Wnt信号途径的活化反馈调节DKK1基因的表达。　　 [方法]用Western blot和免疫荧光方法检测肝癌细胞株中DKK1表达和β-catenin定位的情况。选用不同细胞株分别干扰β-catenin基因的表达和转入β-catenin突变体提高β-catenin基因的表达,Western blot方法检测DKK1基因表达水平的改变。分别选用存在β-catenin基因突变和不存在β-catenin基因突变的肝癌细胞株,以TOPflash/FOPflash作为报告质粒,pRL-SV40质粒作为内对照,用双荧光素报告系统、Westernblot和免疫荧光方法检测DKK1对Wnt信号变化的影响。用组织芯片免疫组织化学方法分析临床病例中DKK1表达和β-catenin定位的关系。　　 [结果]在肝癌细胞株中DKKl的表达水平和β-catenin定位相关;干扰和提高β-catenin基因的表达可相应降低和上调DKK1基因的表达水平。DKK1能够抑制HuH-7细胞中Wnt-3a活化信号,不抑制β-catenin突变体活化信号,同时DKK1不抑制β-catenin存在突变和胞浆/核累积的肝癌细胞株HepG2、MHCC97L中活化的Wnt信号;在这两类细胞株中DKK1也相应的改变或不改变β-catenin表达和定位的情况。部分DKK1表达病例β-catenin存在突变,大样本量临床病例中组化分析显示DKK1表达与β-catenin胞浆/核累积具有相关性。　　 [结论]在肝癌细胞中,由于β-catenin基因的突变使DKK1对于Wnt信号途径的抑制作用丧失;而Wnt信号途径的活化可以反馈调节DKK1基因的表达。　　 第二部分　　 DKK1在临床肝癌病人预后分析中的应用　　 [目的]探讨DKK1表达情况与肝癌病人预后(总体生存和无瘤生存)及肝癌病人临床病理特征间的关系。　　 [方法]应用免疫组织化学染色方法研究肝癌组织芯片中DKK1表达及β-catenin定位的情况。单因素方差分析比较组间差异,卡方检验或Fisher精确概率法比较不同DKK1和β-catenin表达组间阳性率的差别,Kaplan-Meier法计算各组间不同生存率,Log-rank检验比较生存期差别。用Cox比例风险模型进行多因素分析以了解各个相关因素对总体生存率和无瘤生存率的影响。　　 [结果]临床病例中DKK1组化分析显示DKK1表达与肝癌病人总体生存和无瘤生存相关,DKK1高表达肝癌病人,包括AFP阴性和TNMⅠ期病人,存在较差的预后。多因素分析显示DKK1是肝癌病人总体生存和无瘤生存的独立预后指标。DKKl高表达与β-catenin胞浆/核定位显著相关,DKK1/β-catenin双阳性的肝癌病人更倾向于多结节或弥散型复发和肝外转移,而这部分病人也存在更差的预后;DKK1/β-catenin也是影响肝癌病人总体生存率和无瘤生存率的独立因素。　　 [结论]DKK1高表达肝癌病人存在较差的预后,DKK1可以作为肝癌的预后指标。　　 第三部分　　 DKK1对肝癌细胞侵袭转移的影响及其分子机制　　 [目的]探讨DKK1基因在肝癌侵袭和转移中的作用和DKK1参与肝癌侵袭转移的分子机制。　　 [方法]用定量PCR和Westernblot方法检测肝癌细胞株和临床肝癌标本中DKK1的表达情况。通过化学合成RNA干扰片段瞬时干扰和质粒载体稳定转染干扰HCCLM3细胞DKK1的表达,体外损伤修复实验、侵袭实验和裸鼠体内实验检测下调DKK1表达前后肝癌细胞侵袭转移能力的改变情况。对3种肝癌细胞株DKK1高、低表达情况下的细胞进行表达谱芯片分析,利用配对t检验比较DKK1高表达组和DKK1低表达组之间的差异基因,分析这些差异基因相关的癌相关信号通路,进一步采用定量PCR对芯片结果进行验证,并在临床病例中检测这些分子的表达与DKK1表达的相关性。　　 [结果]DKK1基因在侵袭性肝癌细胞株和发生复发的肝癌病人中高表达。体外损伤修复实验、侵袭实验证实,当DKK1被干扰后,肝癌细胞增殖能力没有发生改变而细胞侵袭被抑制。裸鼠体内实验显示干扰DKK1表达后显著抑制肝癌细胞肺转移的发生。DKK1高表达组对比DKK1低表达组在基因表达谱上存在显著差异,涉及VEGF、NF-κB、PI3K和Integrin等癌相关信号通路;MMP16、KDR、PTPRA这3个在两组中差异显著的基因与肿瘤侵袭转移密切相关,定量PCR验证结果与基因芯片结果一致。在66例临床组织标本中MMP16、KDR、PTPRA的mRNA表达水平都与DKK1的表达水平成正相关,因而DKK1可能通过影响MMP16降解细胞外基质和通过KDR促进肿瘤血管形成等途径参与肿瘤侵袭转移过程。　　 [结论]DKK1通过影响细胞外基质的降解和肿瘤血管的形成等促进肝癌侵袭和转移的发生。