背景胸主动脉夹层(Thoracic Aortic Dissection,TAD)指多种原因造成的胸主动脉内膜破裂,血液经破口进入动脉壁中层与外层间隙内,并形成一个假腔,是一种严重危及生命的主动脉疾病。该病发病凶险,死亡率高,但目前发病机制仍不完全清楚。血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cell,VSMC)是胸主动脉中膜的主要成份,存在收缩型和合成型两种表型。前者分化程度较高,增殖、迁移能力较弱；其特有的标志物为α-平滑肌肌动蛋白(Smooth Muscle α-Actin,α-SMA)、平滑肌22α (Smooth Muscle 22α,SM22α)等。而后者分化程度较低,增殖、迁移能力较强,其标志物是骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、表皮生长因子Epiregulin等。当VSMC向合成型转化后,合成型标志物表达水平上调；而向收缩型转化时,收缩型标志物表达水平上调。正常情况下,VSMC以收缩型存在利于对抗血管张力并维持血管壁稳态。然而,当VSMC受不同病理和生理刺激后会发生表型改变,即由收缩型向合成型转变,开始增殖、迁移并合成过多的细胞外基质,从而导致主动脉血管壁组织的病理生理改变。研究发现,TAD中VSMC主要以合成型的形式存在,可使胸主动脉壁变得易于破裂,提示VSMC由收缩型向合成型的表型转化是导致TAD发生的重要因素。进一步的研究表明,转化生长因子-β (Transforming growth factor-β,TGF-β)可以诱导VSMC增殖及迁移,并且促使静止的收缩型VSMC转化成活化的合成型VSMC进而参与血管重构,其中TGF-p,是导致VSMC发生表型转化的重要因子。多种信号通路参与了这一过程,即其通过激活下游信号通路发挥作用。这些信号通路有两大类：1、依赖Smad蛋白的经典信号通路：TGF-β与TGF-β受体-II结合,从而活化TGF-β受体-I,继而使Smad2和Smad3蛋白磷酸化,并与Smad4形成一种Smad2/3-Smad4复合体,通过调整胞核转录因子的位置而激活TGF-P目标基因的转录,从而影响细胞增殖、生长、发育和死亡；2、非依赖Smad的信号通路,如磷脂酰肌醇-3-激酶／蛋白激酶B(Phosphoinositide-3-kinase/Protein Kinase B,PI3K/PKB或PI3K/AKT)、p38、ERK等。PI3K/AKT等非依赖Smad信号近年来日渐被重视,这些信号通路可能独立或者与依赖Smad蛋白的信号通路联合发挥调节作用。P13K是具有催化活性的胞内信号蛋白,可调控下游的AKT的磷酸化水平,共同构成PI3K/AKT信号转导通路。通过将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,PI3K/AKT信号通道在细胞的生长、增殖及凋亡等活动中发挥着重要的调节作用,引发细胞的增殖、分化及凋亡等一系列生物学反应。研究显示,PI3K/AKT信号通路与血管平滑肌的收缩功能相关,参与了VSMC功能异常、血管收缩及血管重塑过程等。同时发现,PI3K/AKT参与了VSMC表型调节,并通过活化下游转录因子发挥作用,但具体下游因子仍不清楚。近来国外研究表明,DNA结合抑制因子2 (DNA binding inhibitory factor 2,ID2)作为一种转录调控因子,在肌细胞生长、增殖和分化中起重要的调节作用；VSMC表型转化的重要特征是迁移和增殖力的增强,而ID2很可能是这种转化的一个重要调节因子。近期数据显示,ID2、ZEB1等转录调节因子在平滑肌细胞表型转化中有重要作用。同时,我们之前的研究(人体标本检测)发现TAD患者较正常人主动脉壁中ID2表达明显上调,且夹层患者主动脉壁VSMC存在明显的表型转化(实验数据暂未发表),提示ID2可能参与了该转化过程。尽管上述证据提示ID2可能参与了VSMC表型转化过程,但是其具体作用及与PI3K/AKT信号通路之间的联系目前仍不清楚。本研究通过对细胞表型标志性蛋白的检测及骨架形态、增殖、迁移能力的分析,判断VSMC处于哪种表型,是否发生了表型转化,再对TGF-β1调节的PI3K/AKT诱导VSMC表型转化的下游信号通路进行探讨,可阐明引起VSMC表型转化的分子机制,其结果将为探讨TAD发病机制拓宽视野,有助于手术方式和时机的选择,并可为防治TAD的内科药物治疗提供可能的分子新靶点,对新药物的研究进行新探索,并为夹层患者的进一步基因治疗提供理论依据。第一部分：目的：探讨不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)对人主动脉平滑肌细胞(HA.VSMCs)增殖及迁移的影响。方法：体外培养人主动脉平滑肌细胞,用不同浓度(0、0.05、0.1、0.5、1、 2、5、10ng/ml)的重组人TGF-β1进行干预,分别在干预后第0、6、12、24、36h 5个不同时间点进行CCK-8试验或24h后进行Transwell迁移试验,观察细胞增殖及迁移情况。结果：当TGF-β1浓度小于5ng/ml时,随着刺激浓度增加,人主动脉VSMCs增殖水平逐渐升高,而大于5ng/ml时,细胞增殖水平降低。不同浓度TGF-β1(0、 0.05、0.1、0.5、1、2、5.10ng/ml)干预细胞,随着作用时间延长,细胞增殖水平逐渐升高,在24h时达到高峰,之后逐渐降低。其中,TGF-β1浓度为5ng/ml且培养时间为24h时细胞增殖水平最高(OD值：0.843±0.016)(P<0.01)。当TGF-β1浓度小于等于5ng/ml(0、0.05、0.1、0.5、1、2.5ng/ml)且作用时间为24h时,随着TGF-β1浓度增加,入主动脉VSMCs迁移水平不断升高,其中以TGF-β1浓度为5ng/ml时细胞迁移水平最高(迁移细胞数：84.667±0.577)；而大于5ng/ml时,细胞迁移水平降低(迁移细胞数：69.667-4-1.528)(P<0.01)。结论：5ng/ml的TGF-β1作用24h更能刺激人主动脉平滑肌细胞发生增殖及迁移。第二部分：实验一：目的：探讨PI3K/AKT信号通路在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用。方法：体外培养的人主动脉VSMC被分成5组：①空白对照组；②TGF-β1组;③TGF-β1抑制剂组；④AKT抑制剂组；⑤双抑制剂组；分别进行不同预处理,24h后通过CCK-8、Transwell试验检测各组细胞增殖、迁移能力,考马斯亮蓝染色检测其细胞骨架形态；Western Blot检测各组细胞PI3K、AKT、P-PI3K、 P-AKT、ID2、SM22α、α-SMA、OPN的表达水平；qRT-PCR检测各组细胞PI3K、 AKT、ID2、SM22α、α-SMA、OPN的mRNA含量。结果：TGF-β1组VSMC增殖与迁移显著增多,双抑制剂组细胞增殖与迁移显著降低。TGF-β1刺激后可使肥胖型VSMC细胞较多,且呈峰谷状生长；而其余四组细胞主要保持细长梭形,其中以双抑制剂组最为明显。TGF-β1可促进PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ID2、OPN的蛋白表达,而抑制α-SMA、SM22α蛋白表达,双抑制剂组与TGF-β1组结果相反。TGF-β1刺激后PI3K、AKT、ID2、 OPN mRNA含量最高,而α-SMA、SM22α mRNA含量最低,双抑制剂组与TGF-β1组结果相反。结论：PI3K/AKT/ID2途径参与了TGF-β1介导的人主动脉平滑肌细胞表型转化过程,TGF-β1、AKT特异性抑制剂(SB525334, MK2206-2HCL)及双抑制剂(SB525334+MK2206-2HCL)均可抑制这一表型转化过程,但双抑制剂较单一抑制剂抑制更能有效抑制其表型转化。以双抑制剂为研究方向,望能为以表型转化为病理基础的TAD的防治提供新思路。实验二：目的：观察DNA结合抑制因子2(ID2)在人主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用。方法：首先设计并合成靶向ID2的siRNA并转染人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMCs),实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)筛选出沉默效率最高的siRNA序列。生物合成人ID2序列,将其插入pIRES2-ZsGREEN1质粒载体,构建过表达ID2重组质粒载体pIRES2-ZsGREEN1-ID2并鉴定。细胞培养后分5组：正常组、空质粒对照组、ID2过表达组、siRNA对照组、ID2 siRNA组,正常组不导入质粒,空质粒对照组脂质体介导法导入pIRES2-ZsGREEN1质粒,ID2过表达组导入pIRES2-ZsGREEN1-ID2质粒,siRNA对照组直接导入非同源siRNA (siRNA NC)、ID2 siRNA组导入ID2 siRNA, qRT-PCR及Western Blot检测其ID2、平滑肌22α (SM22a)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、骨桥蛋白(OPN) mRNA及蛋白表达。结果：成功设计具有较高沉默活性的ID2 siRNA,并成功构建了pIRES2-ZsGREEN 1-ID2过表达重组质粒；与正常组、空质粒对照组、siRNA对照组相比,ID2过表达组的ID2、OPN mRNA和蛋白表达明显升高[ID2 mRNA:2.637±0.053; OPN mRNA:1.692±0.086; ID2:0.580±0.017 OPN:0.460±0.015], SM22α、α-SMA mRNA蛋白表达显著降低[SM22a mRNA:0.367±0.048; α-SMA mRNA:0.428±0.031; SM22a:0.100±0.004; α、MA:0.063±0.010] (P<0.01),而ID2 siRNA组ID2、OPN mRNA和蛋白表达明显降低[ID2 mRNA:0.322±0.046; OPN mRNA:0.250±0.056; ID2:0.061±0.007; OPN:0.066±0.006], SM22a、α-SMA mRNA和蛋白表达显著升高[SM22a mRNA:1.827±0.041;α-SMA mRNA:1.653±0.088; SM22a:0.547±0.009; α-SMA:0.671 ±0.051] (P<0.01)。结论：过表达ID2基因可诱导人主动脉VSMC发生由收缩型向合成型的表型转化,而沉默该基因可抑制这一过程。ID2直接参与调节人主动脉VSMC表型转化。