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在真核生物细胞中,mRNA的降解是基因表达的一个重要过程,它决定了mRNA在细胞质中的丰度。无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)就是一种耦联翻译的mRNA降解机制,它可以识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons,PTCs)的异常转录本,从而避免潜在毒性截短型蛋白质的表达。NMD途径可以有效监控mRNA的质量,保障基因精准表达。尽管对NMD途径机制的研究在哺乳动物、果蝇和酵母等后生动物细胞中取得了一些进展,但关于无义mRNA的识别和降解机制仍然没有被清楚的阐释,还存在诸多争议。原生动物作为一类单细胞真核生物,其NMD途径机制得到了一些初步研究,但是相关的研究报道相对于后生动物比较匮乏。由于其进化上的特殊性和细胞结构的简洁性,对原生动物NMD途径的研究有助于阐明真核生物NMD途径的进化和分子机制。本文在对原生动物八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)细胞中无义mRNA识别和降解过程中的关键因子进行生物信息学鉴定的基础上,利用含有荧光蛋白基因的大核人工染色体,对这些关键因子在细胞中进行了共定位分析,主要研究结果如下:1.通过生物序列的同源搜索,从八肋游仆虫大核基因组数据库中鉴定到11种NMD途径因子的相关基因。这些因子包括无义mRNA识别因子poly(A)结合蛋白(poly(A)binding protein,PABP);启动NMD途径的核心因子上游移码蛋白1(Upframeshift 1,UPF1)和上游移码蛋白2(Up-frameshift 2,UPF2);外显子连接复合体(exon junction complex,EJC)组分因子MAGO(Mago nashi)、Y14(Tsunagi或RMB8)、eIF4AIII(Eukaryotic initiation factor 4A3)和UAP56(U2AF56 Associated Protein 56);无义mRNA降解的相关因子外切体(exosome)、脱帽酶(Decapping mRNA 2,DCP2)、外切酶(5′-3′exoribonuclease 1,XRN1)和去腺苷酸化酶(PGK promoter directed over production,POP2),其中DCP2、XRN1和POP2是mRNA加工小体(processing body,P-Body)的组分。2.利用InterPro Protein在线预测了各个因子的功能结构域,为进一步研究各个因子的功能提供数据支持。3.分别利用Swiss-model和Zhang Lab(I-TASSER)在线预测了UPF1和UPF2蛋白质三级结构,再利用ZDOCK SERVER在线对这两个蛋白结构进行分子对接。对接完成后的模型采用PDBePISA在线进行相互作用关键氨基酸位点分析。分析结果表明,UPF1起关键作用的氨基酸残基是Val108,Val111,Phe145,Leu147,Ile186和Lys189。UPF2起关键作用的氨基酸残基是Phe772、Leu776、Met779、Ile780、Phe784和Lys786。4.通过定点突变将UPF2-U1BD结构域上αA-helix结构所对应的基因突变缺失,体外原核表达蛋白质,经过Pull-down实验证实八肋游仆虫UPF2通过其保守的αAhelix结构与UPF1相互作用,这个结果与人类细胞中的分子机理相同。5.利用八肋游仆虫大核人工染色体对NMD途径因子定位和共定位。通过荧光共定位结果,分别依次验证了UPF1与UPF2之间、EJC组分因子之间和P-body组分因子之间的相互作用关系。然后,通过UPF2分别与MAGO和Y14的荧光共定位结果,结合本实验室前期的体外研究成果,证实无义mRNA的识别需要EJC。然后根据UPF1分别与DCP2和exosome的荧光共定位实验结果,推测了无义mRNA的两种可能的降解方式:一种是无义mRNA被介导到P-body中分别被DCP2和POP2脱去5′端帽和3′端Poly(A)尾,接着在XRN1的作用下,沿着5′→3′的方向降解;另一种是在胞质中,无义mRNA直接通过招募POP2去腺苷酸化,随后又在招募来的exosome的作用下,沿着3′→5′的方向降解。主要结论:根据本研究的结果及本课题组前期研究成果,推测了八肋游仆虫NMD途径模型。(1)在无义mRNA的识别机制上,以一种依赖于EJC的方式,招募核心因子UPF1和UPF2,再与肽链释放因子和EJC结合形成eRF-UPF-EJC复合体。UPF2与UPF1之间的相互作用可能通过其保守的αA-helix结构。(2)在无义mRNA的降解机制上,无义mRNA可能被介导到P-body中,经过DCP2和POP2脱帽和去尾后,在XRN1的作用下沿着5′→3′的方向降解。或者无义mRNA直接在细胞质中,经过POP2去尾后,在exosome的作用下,沿着3′→5′的方向降解。