【背景】MiRNAs (microRNAs),是近年来分子生物学领域主要的研究热点之一。功能研究提示miRNAs几乎参与了所有人类已知的细胞进程的调控,包括肿瘤在内的人体许多病理进程中都检测到了miRNAs表达的变化。在后生动物和植物中,miRNAs是转录后水平基因表达的关键调控因子。越来越多的研究表明,miRNAs在人类癌症起始和进展过程中发挥着重要的调控作用,功能上充当癌基因或抑癌基因的角色。胃癌是人类第二大最主要癌症相关性死亡病因,日本,韩国和中国所在的亚洲东北部则是世界上胃癌发病率最高的地域。胃癌给国人的健康造成了巨大威胁。而胃癌确切的发病机制仍不清楚,缺乏特异性的治疗靶点。因此,从不同的角度、不同的分子水平探索胃癌发生发展的机制,或许能找到治疗胃癌的突破口。miRNAs的发现无疑给人类战胜胃癌带来了新的希望,其在胃癌中的作用还远远未被阐明。本研究即从增殖这个胃癌最基本的恶性表型入手,探讨miRNAs在胃癌增殖中发挥的调控作用。【目的】基于高通量功能获得性筛选寻找抑制胃癌细胞增殖的miRNAs分子群;对其中关键miRNAs分子抑制胃癌增殖的作用进行验证;探讨关键miRNAs分子抑制胃癌细胞增殖的机制;并进一步探讨关键miRNAs分子在胃癌组织中的表达水平与胃癌患者临床病理特征及预后的相关性;从而从转录后水平揭示胃癌增殖的新机制,为胃癌治疗提供新的靶点,也为关键miRNAs分子将来有可能应用于临床奠定初步的实验基础。【方法】1.利用miR-Ribo? miRNA mimics Library (Human) v14.0文库(库容量:904个人类miRNAs mimics),借助RT-CES系统对胃癌细胞SGC 7901基于增殖表型进行高通量功能获得性筛选,获得了12个抑制胃癌细胞增殖的miRNAs分子,其中miR-137抑制胃癌细胞增殖效果最为显著。2.Real time RT-PCR验证miR-137在人胃癌细胞系(SGC7901、AGS、MKN45)、永生化正常人胃粘膜上皮细胞GES-1和11例原发性胃腺癌组织及配对正常胃粘膜组织中的表达。3.上调miR-137在胃癌细胞系SGC7901、AGS中的表达,MTT、平板克隆及软琼脂克隆形成等体外实验验证miR-137对胃癌细胞增殖的影响。4.构建miR-137过表达慢病毒载体,并成功建立miR-137过表达的稳转细胞系LV-miR-137 SGC7901,裸鼠皮下成瘤实验验证miR-137对体内成瘤的影响。5.上调miR-137在SGC7901、AGS中的表达,流式细胞术检测miR-137对SGC7901、AGS细胞周期和凋亡的影响,EdU细胞增殖实验检测miR-137对SGC7901和AGS DNA复制能力的影响。6.运用生物信息学方法,预测miR-137可能的下游靶基因,并对预测的靶基因进行功能聚类分析,结合文献、预实验验证等方法,初步判断CDK6可能是miR-137的靶基因之一。7.在3例原发性胃腺癌组织及配对正常胃粘膜组织中,分别用real time RT-PCR和Western Blot检测miR-137和CDK6的表达,探讨miR-137和CDK6表达的相关性。8.转染miR-137 mimics上调SGC7901和AGS中miR-137的表达,real time RT-PCR、Western Blot检测CDK6在mRNA水平和蛋白质水平的变化;转染miR-137 inhibitor下调GES-1中miR-137的表达,real time RT-PCR、Western Blot检测CDK6在mRNA水平和蛋白质水平的变化。构建野生型CDK6 3′UTR的萤光素酶报告载体psiCHECK2-CDK6和突变体psiCHECK2-CDK6-mut,分别与miR-137 mimics共转染,检测萤光素酶活性变化。9.转染siCDK6下调CDK6在SGC7901和AGS中的表达,MTT比色实验检测SGC7901和AGS增殖的变化,同时流式细胞术检测SGC7901和AGS细胞周期的变化。10.Real time RT-PCR检测miR-137在38例石蜡包埋胃腺癌组织中的表达水平,并将miR-137在胃癌组织中的表达水平与患者临床病理特征及预后进行统计学分析。【结果】1.高通量获得性筛选得到12个显著抑制胃癌细胞增殖的miRNAs分子,其中miR-137可能是抑制胃癌细胞增殖的关键分子。我们借助RT-CESTM系统对miR-Ribo? miRNA mimics Library (Human) v14.0文库904条人类miRNAs mimics进行了高通量功能获得性筛选。Z score <-3的miRNAs mimics被认为是显著抑制SGC7901增殖的阳性分子。基于以上筛选策略,我们得到了12个显著抑制SGC7901增殖的miRNA分子,分别是miR-30b,miR-137,miR-363,miR-124*,miR-15a,miR-149,miR-15b*,miR-376b,miR-571,miR-622,miR-339-3p和miR-1321。其中miR-137抑制胃癌细胞SGC7901增殖效果最为显著(Z Score= -3.84,Relative growthrate=0.51),提示miR-137可能是抑制胃癌增殖表型的关键miRNA分子。2.miR-137在胃癌细胞系和原发性胃腺癌组织中表达水平显著下调。我们用real time RT-PCR方法分别在胃癌细胞系及原发性胃腺癌组织中检测了miR-137的表达水平。结果提示,相对于正常胃粘膜上皮细胞GES-1,miR-137在胃癌细胞系表达水平显著降低;相对于正常胃粘膜上皮,miR-137在原发性胃腺癌组织中表达水平亦显著降低。3.上调miR-137的表达能显著抑制胃癌细胞增殖,导致细胞周期G1/S阻滞。分别在SGC7901及AGS中上调miR-137的表达,MTT比色实验、平板克隆及软琼脂克隆形成等体外功能实验检测了miR-137对胃癌细胞增殖的影响,结果显示,与转染阴性对照的对照组相比,上调miR-137表达能显著抑制SGC7901及AGS细胞增殖。我们构建了miR-137过表达慢病毒载体,并成功建立了miR-137过表达的稳转细胞系LV-miR-137 SGC7901。裸鼠皮下成瘤实验显示上调miR-137的表达能够显著抑制胃癌细胞体内成瘤的能力。流式细胞周期检测提示上调miR-137的表达能够导致SGC7901和AGS出现G1/S期阻滞,对凋亡无明显影响。EdU细胞增殖检测提示上调miR-137的表达能够显著抑制SGC7901和AGS细胞的DNA复制。4.生物信息学预测提示CDK6可能是miR-137的靶基因。我们借助了多种预测软件对miR-137的靶基因进行了预测,结果显示TargetScan、PicTar、miRanda和RNAhybrid 4种预测软件均能预测到CDK6为miR-137的靶基因。CDK6 3′UTR与miR-137“种子区”序列匹配,且CDK6是促进细胞周期进展的关键分子,我们初步选定CDK6作为miR-137下游关键分子进行研究。5.miR-137和CDK6在胃癌组织及正常胃粘膜组织中的表达水平呈显著负相关。我们在3例原发性胃腺癌组织及配对正常胃粘膜组织中,分别用realtime RT-PCR和Western Blot检测了miR-137和CDK6的表达水平,结果提示miR-137与CDK6在胃癌组织及正常胃粘膜组织中的表达水平呈显著负相关。6.miR-137负性调控CDK6的表达。我们在miR-137低表达的SGC7901和AGS细胞系上调miR-137的表达,结果提示,和对照组相比,上调miR-137表达后CDK6在mRNA水平和蛋白水平表达水平均显著下调。我们又在miR-137高表达的GES-1细胞系转染miR-137 inhibitor下调miR-137的表达,结果提示,和对照组相比,下调miR-137表达后CDK6在mRNA水平和蛋白水平表达均显著升高。双荧光素酶报告基因实验提示miR-137能够显著抑制野生型psiCHECK2-CDK6及突变体psiCHECK2-CDK6-mut1(7133-7139位碱基)或psiCHECK2-CDK6-mut2(7114-7120位碱基)的萤光素酶活性,而对对照组lucCtrl和突变体psiCHECK2-CDK6-mut3(mut1+mut2)的萤光素酶活性无影响,从而进一步确证了CDK6为miR-137的靶基因;通过与CDK6 3′UTR 7114-7120和/或7133-7139位碱基相互作用,miR-137负性调控CDK6的表达。7.miR-137通过负性调控CDK6抑制胃癌增殖。用siCDK6下调CDK6在SGC7901和AGS中的表达,MTT比色实验结果提示SGC7901和AGS增殖能力显著减弱,进一步流式细胞周期检测提示SGC7901和AGS出现了G1/S期阻滞。综上,下调CDK6的表达引起的胃癌细胞增殖抑制及细胞周期G1/S期阻滞效应与上调miR-137在胃癌细胞的表达引起的效应类似,且效果相当。所以,miR-137抑制胃癌细胞增殖的机制,至少部分可以归结为miR-137通过对其下游靶基因CDK6的负性调控,导致胃癌细胞出现G1/S期阻滞所致。8.miR-137在原发性胃腺癌组织中的表达水平与患者临床病理特征及预后显著相关。我们将miR-137在38例石蜡包埋胃腺癌组织中的相对表达水平与胃癌患者临床病理特征及术后生存时间进行统计学分析发现:miR-137的表达水平与肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移显著相关(p<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关。miR-137高表达组(n=19)患者术后生存时间显著优于低表达组(n=19)(Log Rank=6.981,P=0.008)。【结论】基于胃癌增殖表型的高通量功能获得性筛选,我们首次发现了一个抑制胃癌增殖的miRNAs分子群,而miR-137可能是这个群体中调控胃癌增殖的关键miRNA分子;miR-137通过负性调控CDK6的表达引起细胞周期G1/S期阻滞,从而从转录后水平阐明了一个抑制胃癌增殖的新机制,为治疗胃癌提供了新的靶点;miR-137在原发性胃腺癌组织中的表达水平与患者预后显著相关,有望成为新的胃癌预后预警分子。