目的:　　 遗传性凝血因子V(FV)缺陷症又称Owren病或副血友病，是一种罕见的常染色体隐性遗传性出血性疾病，在人群中的发病率约为1/1000，000，男女均可罹患。由于其发病率低以及FV基因的复杂性，分子发病机制研究目前仍较少。FV又称为前加速素或易变因子，是由凝血酶原酶复合物催化快速生成凝血酶所必需的蛋白辅因子，对维持出凝血平衡起着重要作用。FV缺陷症患者出血程度轻重不等，出血症状大多发生于6岁以前，以鼻衄、口腔黏膜出血、女性月经量过多、外伤和术后出血相对常见。FV缺陷通常表现为促凝功能下降，FV促凝活性(FV：C)降低，血浆凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)显著延长。目前国内外报道的FV缺陷症患者均为散发，且大多有自发性或继发性出血史。本研究通过对两例无出血症状的FV缺陷症患者及其家系进行FV表型分析和FV基因筛查，旨在探讨无出血症状凝血因子V缺陷症的分子发病机制。　　 方法:　　 一、研究对象　　 1、家系1：先证者，女，62岁，温州文成人。育有4子女，曾行输卵管结扎术，自诉无出血病史。先证者因做白内障手术来诊，术前行凝血常规检测发现PT31.5s/13.0s～14.2s，APTT104.1s/31.2s～40.6s，两者均显著延长，患者无肝肾功能障碍。进一步做凝血因子活性检测，发现FV：C为4％，明显下降。家系其他成员均无出血史，先证者父母非近亲婚配。　　 2、家系2：先证者，女，41岁，温州苍南人，于2009年12月在苍南人民医院做翼状胬肉切除术，术后愈合良好，无出血事件发生。术后，先证者于2010年1月来我院复查，凝血常规检测发现PT23.6s/13.0s～14.2s，APTT75.9s/31.2s～40.6s，两者均显著延长，患者无肝肾功能障碍。进一步做凝血因子活性筛查，发现FV：C为5％，明显下降。此后，先证者于2010年2月发生车祸，踝骨处软组织外伤，行外科缝合术，共6针，8天拆线，伤口愈合良好。家系其他成员均无出血史，先证者父母非近亲婚配。　　 3、正常对照：100例，男57例，女43例，平均年龄35(22～67)岁，均为我院健康体检者。对照组经查均无肝肾功能疾病，无血栓或出血史，采样前已征得本人同意。　　 二、样本的采集和处理　　 在征得患者及家系成员知情同意后，采集家系成员静脉血，109mmol/L枸橼酸三钠1：9抗凝，4℃3000r/min离心15min，取乏血小板血浆，分装，-70℃保存。DNA提取试剂盒抽提家系所有成员外周血细胞基因组DNA，-70℃保存待用。　　 三、FV表型检测　　 1、STAGO-STA-R全自动血凝仪检测PT、APTT、FⅡ活性(FⅡ：C)、FV：C、FⅦ活性(FⅦ：C)、FX活性(FX：C)。因子活性检测采用一期凝固法，试剂盒由法国STAGO公司配套提供。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。　　 2、FV抗原(FV：Ag)检测：采用ELISA法(由上海交通大学附属瑞金医院完成)。　　 四、FV基因分析　　 根据FV基因序列(GenBankAY364535)，应用primer5.0软件共设计30对引物以覆盖FV基因的所有外显子区域及其侧翼序列。PCR反应在扩增仪(ABIThermlcycler2720，USA)上进行，PCR产物送上海桑尼生物科技有限公司，胶纯化回收制备模板，采用双脱氧链终止法在3730XLABI测序仪上进行测序，用Chromas软件将测序结果与美国基因库(NCBl)所公布的AY364535序列进行在线比对(Blaster)，以寻找基因变异。　　 结果:　　 一、FV表型检测结果　　 两家系先证者PT、APTT均显著延长，患者1分别为31.5s和104.1s；患者2分别为23.6s和75.9s。患者1FV：C为4％，FV：Ag为2.62％；患者2FV:C为5％，FV：Ag为18.46％，两者均显著减低。两家系其他成员PT和APTT基本在正常参考范围内。除家系1外孙女Ⅳ2和家系2二姐112外，其他家系成员FV：C水平和FV:Ag含量均有不同程度降低。　　 二、FV基因检测结果　　 两个家系FV基因筛查共发现28个点突变，均为单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphismSNP)位点，未发现新的基因突变。　　 1、家系1：　　 在先证者及家系成员的13、15和16号外显子共发现12个SNP位点，包括6个同义突变位点和6个错义突变位点，其中B结构域10个，A3结构域2个。　　 2、家系2：　　 在先证者及家系成员的外显子4、8、9、11、12、13、15、16和25共发现16个SNP位点，包括8个同义突变位点和8个错义突变位点，其中A1结构域2个，A2结构域5个，B结构域6个，A3结构域2个，C2结构域1个。　　 3、两个家系共同的SNP位点有8个，如下：p．717Asn(g.45550A＞G)，p．Lys830Arg，p.His837Arg,p.Lys897Glu,p.1240Ser(g.47153G＞T),p.Pro1376Ser,p.1646Gly(g.57433T＞C),p.Met1736Val。　　 结论:　　 1、通过对两个家系FV基因筛查共发现28个点突变，均为单核苷酸多态性位点，未发现新的基因突变。　　 2、FV活性的下降程度并不是决定FV缺陷患者临床症状轻重的唯一因素，FV的表型和基因型没有很好的一致性。　　 3、本研究中两例FV缺陷症患者的无出血症状可能与SNP位点有关，尤其是与APC抵抗关联的一些SNP位点。　　 4、本研究中两例患者FV:C水平和FV:Ag含量下降可能与所发现的SNP位点有关。　　 5、推测先证者FV基因中尚潜在基因变异位点，有待进一步深入研究。